熒光標記抗體方法有直接標記法和間接標記法兩種。
(1) 直接法：較為常用，具體步驟是：
1) 抗體溶液的制備：用 0.01mol/L pH 7.1 PBS 將待標記抗體稀釋至 20mg/ml;
2) 熒光素：根據待標記抗體的總量，按 0.01mg 熒光素/mg 蛋白，將熒光素溶解于 0.5mol/L pH 9.5 碳酸鹽溶液中，體積為抗體溶液的 1/10;
3) 標記：于4℃條件下，抗體溶液放置在磁力攪拌機上，將熒光素逐滴緩慢加入，同時保持反應液pH 值在8.5左右，如此連續攪拌反應 4～6h。應盡量避免產生泡沫，避免將熒光素粘在容器壁及攪拌棒上；
4) 透析：標記后的抗體溶液 2500r/min 離心 20min, 取上清在 10～50 倍體積的 pH 8.0 PBS中透析2～4h;
5) 標記抗體的純化： Sephadex G-50 凝膠過濾去除游離熒光素。本法標記均勻，重復性好，極少產生非特異性熒光，蛋白質也少變性，熒光亮度好，保存時間長。
(2) 間接法：
1) 抗體溶液的制備：用 0.025mol/L pH 9.5 PBS將待標記抗體稀釋至10mg/ml, 裝入透析袋中；
2) 熒光素溶液的配制：根據待標記抗體的總量，按 0.05mg 熒光素/mg蛋白稱取熒光素，溶解于0.025mol/L pH 9.5 碳酸鹽溶液中，體積是抗體溶液的 10 倍；
3) 標記：將透析袋浸泡于熒光素溶液中， 4℃磁力攪拌 16～18h;
4) 標記抗體的純化： Sephadex G-50 凝膠過濾去除游離熒光素。 展開 | 