病毒免疫熒光實驗_熒光抗體的制備

熒光色素

抗體

熒光色素的選擇 可以產生明亮熒光的染料物質，稱熒光色素 (fluorochrome) 。目前常用的熒光色素有以下幾種：

(1) 異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC): 在堿性條件下， FITC 的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個 Ig分子上最多能標記 15-20個FITC 分子。

(2) 四乙基羅丹明 (tetraethylrhodamine B200, RB200) :不能直接與蛋白質結合，需在五氯磷 (PCl₅) 作用下轉變成磺酰氯 (S0₂Cl, 在堿性條件下與蛋白質的氨基反應結合而標記在蛋白分子上。熒光效能較低，一般不單獨使用，多用于與 FITC 標記抗體作雙標記或對比染色。

(3) 四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC): 與蛋白質結合方式同 FITC。它可用于雙標記示蹤研究。

(4) 其他熒光素：如藻紅蛋白 (phycoerythrin, PE) 、藍色熒光素 7-氨基 -4 甲基香豆素(7-amino-4-methy lcoumarin, AMC入得克薩斯紅 (texas red) 等。

用于免疫動物的病毒抗原必須高度提純，盡可能不含其他非特異性的抗原物質，最常用的免疫動物是家兔、山羊和綿羊。用于熒光素標記的免疫血清，需提純后使用，在免疫熒光技術中主要是提純IgG, 其提純方法有飽和硫酸按鹽析法、分子篩層析法（即葡聚糖凝膠過濾）以及離子交換層析法等，也可將鹽析法和層析法結合起來，先用鹽析法粗提，然后再經過層析柱進一步純化。

熒光抗體的制備是免疫熒光試驗的重要技術之一，制備高特異性和高效價的熒光抗體必須選用高質星的熒光素和高特異性、高效價的抗體。