病毒RNA提取可以:(1)用于RNA病毒復制機制研究;(2)用于反向遺傳學研究;(3)用于分子病毒學其他研究。
| 實驗方法原理 | 大多植物病毒RNA 為單鏈RNA ,并且其極性與mRNA 極性相同,植物病毒RNA 提取較為簡單,一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。 |
|---|
| 實驗材料 | TMV病毒液 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | TE-飽和酚:氯仿氯仿NaAc乙醇TE緩沖液雙菌水 |
|---|
| 儀器、耗材 | 冷凍臺式離心機低溫真空干燥儀電泳儀電泳槽 |
|---|
| 實驗步驟 | 一、實驗材料準備
1. 材料 提純TMV病毒液(10 mg/ml)。 2. 設備 冷凍臺式離心機,低溫真空干燥儀,電泳儀,電泳槽。 3. 試劑 TE-飽和酚:氯仿(1:1),氯仿,3 M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE緩沖液,無RNA 酶的雙菌水。 二、操作步驟 1. 取一eppendorf管加入提純TMV(10 mg/ml)400 ml,再加入等體積酚/氯仿,蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘,4℃下12 000 g離心10分鐘。 2. 吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有機相交界面無蛋白為止。 3. 吸取水相于新eppendorf心管,加入等體積氯仿,用手倒置離心管數十秒,4℃下12 000 g離心10分鐘。 4. 取水相,加入1/10倍體積的3 mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻,-20℃30分鐘。 5. 4℃下12 000 g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,4℃下12 000 g離心5分鐘。 6. 小心棄去上清液,沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘,并溶于無RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。 7. 取10 ml進行電泳分析。 收起 |
|---|
| 注意事項 | 1. 整個操作應盡可能在低溫下進行。 2. 由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面,因此要充分剝去病毒外殼蛋白,一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。 |
|---|