病毒RNA提取實驗

TMV病毒液

TE-飽和酚:氯仿 氯仿 NaAc 乙醇 TE緩沖液 雙菌水

冷凍臺式離心機 低溫真空干燥儀 電泳儀 電泳槽

一、實驗材料準備

1.  材料
 

提純TMV病毒液（10 mg/ml）。
 

2.  設備
 

冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。
 

3.  試劑
 

TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3 M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA 酶的雙菌水。
 

二、操作步驟
 

1.  取一eppendorf管加入提純TMV（10 mg/ml)400 ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12 000 g離心10分鐘。
 

2.  吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。
 

3.  吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4℃下12 000 g離心10分鐘。
 

4.  取水相，加入1/10倍體積的3 mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。
 

5.  4℃下12 000 g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12 000 g離心5分鐘。
 

6.  小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。
 

7.  取10 ml進行電泳分析。

1.  整個操作應盡可能在低溫下進行。
 

2.  由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。