PCR 法
斑點雜交法
Southern 雜交法
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 貼壁生長良好的單層 BS-C-1 或 HuTK-143B 細胞 重組病毒噬斑懸液 |
| 試劑、試劑盒 | PBS 胰酶／EDTA 干冰／乙醇 DNA 提取緩沖液 乙酸鈉 乙醇 PCR 擴增緩沖液 引物 完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基 完全 MEM-10／BrdU 培養基 篩選試劑 4 dNTP 混合物 MgCl2 |
| 儀器、耗材 | 24 孔組織培養板 杯狀超聲儀 |
| 實驗步驟 |
實驗試劑準備詳見「其他」。 1. 吸出匯片生長單層細胞的培養基。 1.1 對于 XGPRT 篩選，用 BS-C-1 細胞。 1.2 對于 TK 篩選，用 HuTK-143B 細胞。 2. 用 37℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗細胞 1 次，以除去剩余血清。 3. 用剛好覆蓋單層細胞、37℃ 的胰酶/EDTA（對于 150 cm2 培養瓶需要 1.5 ml）覆蓋細胞。消化 30 s （細胞應該分開），晃動培養瓶使細胞完全分開。 4. 加入 8.5 ml 適當培養基。 4.1 對于 BS-C-1 細胞，使用完全 MEM-10 培養基 4.2 對于 HuTK-143B 細胞，使用完全 MEM-10/BrdU 培養基。吸打細胞懸液數次使團塊散開。 5. 用血球計數器對細胞進行計數。 6. 將 1.25 ×105 細胞/孔放入 24 孔組織培養板培養（每孔終體積為 0.5 ml），至細胞匯片（應小于 24 h）。 7. 將小管中的病毒置于冰水上，在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 20~30 s。 8. 吸出組織培養板中的培養基，用一個重組病毒噬斑感染一個孔的細胞，一般用噬斑懸液的一半體積（如有0.5 ml 的噬斑懸液用 0.25 ml），溫育 1~2 h，期間每隔 15~30 min，輕輕搖晃培養瓶。 9. 加入 1 ml 含適當篩選試劑的完全 MEM-2.5 培養基，培養直到細胞病變（細胞變圓）明顯（一般 24~48 h）。 9.1 對于 XGPRT 篩選，加入 1/400 體積的 10 mg/ml MPA、1/40 體積的 10 mg/ml 黃嘌呤、1/670 體積的 10 mg/ml 次黃嘌呤。 9.2 對于 TK 篩選，加入 1/200 體積的 5 mg/ml BrdU。 10. 用細胞刮刀輕輕刮下細胞，轉移到離心管中，最大轉速離心 30 s。棄培養基；再加入 1 ml PBS，渦旋混勻，最大轉速離心 30 s 棄 PBS，用 0.5 ml PBS 重懸。 11. 反復凍融法裂解細胞懸液：用干冰/乙醇冷凍細胞，再將細胞放入 37℃ 水浴鍋，且渦旋解凍。如此進行 3 次。 12. 將重懸的細胞懸液置于冰水混合物上，在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 20~30 s。 13. 取 50~100 μl 細胞懸液移至微量離心管中。加入 1/10 體積的 DNA 提取緩沖液，輕輕翻轉數次使其混合，37℃ 放置 2 h 至過夜。 14. 用等體積的平衡苯酚抽提 1 次，再用等體積的氯仿抽提 1 次。 15. 加入 1/10 體積 pH 6.0，3 mol/L 的乙酸鈉（終體積為 0.3 mol/L）和 1.5 體積 95% 的乙醇。 -20℃ 放置 20 min。 16. 4℃ 以最大轉速離心 15 min，棄上清。用冰浴的 70% 乙醇洗滌，空氣中晾干。 17. 用 20 μl 去離子水溶解沉淀。在冰上配制下列反應混合物： 10 μl 溶解的模板 DNA 5 μl 10 × 無 MgCl2 的 PCR 擴增緩沖液 5 μl 10 mmol/L 4 dNTP 混合物 5 μl 100 μmol/L 引物 5 μl 15 mmol/L MgCl2 24.5 μl H2O 覆蓋上礦物油。 此步驟使用高保真的 PCR 試劑盒（BoehringerMannheim）更好。 18. 用下列熱循環參數進行 PCR 反應。 35 個循環：20 s 95℃ （變性） 20 s 55～60℃ （復性） 1~2 min 72℃ （延伸） 1個循環：5 min 72℃ （延伸） 最后一步：無限時 4℃ （保存） 此條件適合擴增 1 kb 大小的片段。 19. 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物。
展開 |
| 注意事項 |
1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。 2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。
|
| 其他 |
試劑： 磷酸緩沖液（PBS） 胰酶/EDTA（0.25%:0.02%），37℃ 完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基 完全 MEM-10/BrdU 培養基 篩選試劑（過濾除菌，-20℃ 保存）： 10 mg/ml（400×）麥考酚酸（MPA；Calbiochem），溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 篩選）； 10 mg/ml（40×）黃嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 篩選）； 10 mg/ml（670×）次黃嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 篩選）； 5 mg/ml（200×）5-溴脫氧尿苷（BrdU），溶于水（TK 篩選） 干冰/乙醇 DNA 提取緩沖液 3 mol/L 乙酸鈉，pH 6.0 95% 和 70% 冰浴的乙醇 10 × 無 MgCl2 的 PCR 擴增緩沖液 10 mmol/L 4 dNTP 混合物 100 μmol/L 引物（序列按照插入的外源基因的位點設計） 15 mmol/L MgCl2
展開 |
骨骼肌重塑是維持肌肉內環境平衡和運動能力的關鍵。在小鼠和人類中，肌肉重塑反應在體育鍛煉后迅速開始，從而產生ROS，而線粒體是骨骼肌收縮期間ROS的主要來源之一。體育運動導致的ROS氧化蛋白質、脂肪和核......
盡管針對病毒感染的高度敏感診斷測試取得了很大進展,但其仍需要復雜的技術來準備樣本或解釋結果,這使得它們在醫療資源稀缺地區的推廣變得不切實際。發表在15日《ACS中心科學》雜志上的一種靈敏的方法,可在短......
“我們的成果一旦邁入產業化，腫瘤患者只需打一針就有望治愈，費用將是現在的幾十分之一。”浙江理工大學生命科學與醫藥學院教授李恭楚的這個愿望即將實現。日前，他團隊研發的腫瘤藥物“GC001溶瘤痘苗病毒注射......
美國密歇根大學領導的一個研究小組顯示，由納米顆粒自組裝而成的微米大小的“蝴蝶結領結”，可形成各種不同的扭曲形狀，并能被精確控制。這一進展為輕松生產與扭曲光相互作用的材料開辟了道路，為機器視覺和藥物生產......
各有關實驗室:為進一步提升新冠病毒核酸檢測水平，提高重大傳染病應急檢測能力，保障測量結果準確、有效、一致。中國計量科學研究院先進測量工程中心(計量檢測與校準中心)(中國合格評定國家認可委員會CNAS認......
2月27日，國務院聯防聯控機制召開新聞發布會，國家發展改革委、工業和信息化部、農業農村部、國家衛生健康委、海關總署相關司局負責同志出席發布會，介紹鞏固疫情防控重大成果有關情況，并回答媒體提問。發布會上......
再過幾天就是DNA雙螺旋模型發現70周年。70年前，1953年2月28日，25歲的美國生物學博士沃森和正在攻讀物理學博士學位的37歲英國學者克里克跨界合作，優勢互補，在倫敦卡文迪許實驗室里用鐵板、鐵棍......
近期，國家衛生健康委辦公廳已發出《關于進一步做好新冠病毒實驗室生物安全管理工作的通知》，全國多地衛生健康部門轉發落實。據山西省晉中市衛健委網站2月15日消息，并據安徽省衛健委、北京市衛健委、太原市衛健......
近日，在赤道幾內亞及其鄰國喀麥隆發現了致命的馬爾堡病毒，世界衛生組織（WHO）已聯合當地衛生部門，追蹤該病毒的傳播，并對相關接觸者進行隔離。喀麥隆此前曾發現兩例馬爾堡病毒病疑似病例，幾天前，赤道幾內亞......
正值開學季，學生群體聚集性明顯，極易給傳染病帶來可乘之機。2月13日，烏魯木齊市疾病預防控制中心發布健康提示，春季是諾如病毒感染的高發期，極易在中小學校、托幼機構等集體中引起暴發和流行，開學后，家長要......
