（一）基本概念 為了方便新人與老司機交流，需要掌握一些基本名詞和概念，以便準確的表述問題。這些知識不考試，寫作時間也有限，關鍵還沒有稿費，所以隨便寫寫，沒有咬文嚼字，如果意思表達錯了請指正，形式上就不用對著教科書摳字眼了，謝謝。 1.抗原、抗體，和二抗： 抗原（半抗原）：能夠誘導產生抗體（免疫原性）并且和這個抗體特異性結合（抗原性）的物質，一般稱為大分子物質。半抗原是只有抗原性，而不能誘導產生抗體的物質，稱小分子物質，通常只有一個抗原決定簇。一般低于10KD免疫原性就很差了，但免疫原性與分子量沒有絕對關系，還要看結構的。 抗體：能夠與抗原特異性結合的免疫球蛋白。單抗和多抗，單抗是針對一個抗原決定簇的，單一類型的抗體；多抗是針對同一免疫原（一個或多個抗原決定簇）的不同單抗的混合體。種類上又分IgG、IgM等，IgG又分不同亞型，1、2a、2b等。結構上是Y型，上面兩個相同的可變區Fab與抗原特異性反應，恒定區Fc具有種屬特異性。 二抗：以抗體（通常只是Fc片段）免疫另一物種產生的一種抗體，有多抗比如羊抗鼠IgG（Goat anti mouse IgG），是用鼠IgG的Fc片段免疫山羊，獲得的一種多抗，不管你小鼠單抗是針對什么抗原的IgG（主要是Fab差異），其Fc基本是相同的，所以都能被羊抗鼠IgG結合，常用做C線，但是不同亞型的IgG的Fc段結構有差異（分型的基礎），與二抗的結合效果可能存在區別。也有單抗如鼠抗人IgG、鼠抗人IgM，最常用的間接法（捕獲法）的原料。 雖然我們常用羊抗鼠IgG做C線，但是請注意C線≠二抗，C線用什么就說什么最省事，不要把C線如何如何，說成二抗如何如何，這樣會讓大家誤解你的檢測模式設計。 2.檢測模式：（如圖，手機上看不到，試試電腦版瀏覽，如果還看不到就得留言聯系管理員了） 1）夾心法：
2）間接法（固相包被抗原，標記抗人抗體）和捕獲法（固相包被抗人抗體，標記抗原），其實我覺得沒必要刻意糾結這兩個名詞，反正交流的時候，都免不了被問標記的什么，包被的什么。這兩種方式相當于一個另類的夾心法，調整起來跟夾心法基本想同。
3）競爭法：一切與夾心法反著來。如下圖，人為偏向標記抗體和待測抗原先反應，即正常的不公平競爭模式，有利于消線；還有標記抗原，NC包被抗體的，這樣標記抗原和待測抗原在同一時間與T線抗體競爭結合，是一種公平競爭，靈敏度比前者要差很多。
4）標記抗原還有個搭橋法： 在制作重組抗原的時候，人為嵌入一段便簽序列，這樣做一方面有利于抗原純化；另一方面可以簡化并且高效標記。因為結構原因，抗原標記相比抗體標記，一是容易引起交聯死金，不好順利標記；二是容易掩蓋活性位點，不能有效標記。這時候標簽就能發揮很大作用了，比如你抗原有GST標簽，你可以先在金子上標記抗GST抗體，然后再加進去抗原，形成“金--抗GST抗體--（GST標簽）抗原”這種復合物，相當穩定，而且抗原遠離金子不會形成空間位阻，并且你標記一個GST抗體，所有含GST標簽的抗原都可以拿來搭橋。 3.空間位阻： 就是膠體金顆粒在空間上阻擋了抗體和抗原的接觸和反應，說幾個數據會比較形象：金子常用大小為40nm，IgG抗體一般分子量在160KDa左右，長度約8nm，并且因為抗體的結構原因，一般是Fc結合膠體金，Fab向外伸展，反應部位充分暴露，不存在空間位阻的問題。但是標記重組抗原就不同了，在金標上常用的重組抗原一般15-40Kd，換算過來相當于0.8-2nm左右，并且標記結合部位很隨機，不像抗體那樣天然的遠離反應位點，所以標記時有兩種情況會導至沒有活性，一是直接標記在反應位點上，；二是標記位置非常靠近反應位點，雖然沒有掩蓋，但是因為金子的空間阻擋，抗體還是沒法跟他反應。
4.一些文獻常用詞： 金標試紙條一般是兩條線，質控線（C線，Control line），檢測線（T線，Test line，這里的抗體一般稱呼是coating / capture antibody），金結合墊（conjugate pad，這里的抗體一般叫labeling / detection antibody）。
5.蛋白等電點PI： 蛋白質（氨基酸）是一種兩性電解質，既可以從羧基釋放H+，從而帶負電，也可以讓氨基結合H+而帶正電，到底帶什么電荷取決于所處Ph環境，Ph等于等電點時整體電荷為0（等電點時單個氨基酸理論上有不帶電荷的可能，但是由不同氨基酸組成的蛋白質，應該是帶電荷的，只是所帶正負電荷數相等），大于等電點時整體帶負電（負電荷總數多于正電荷），小于等電點時整體帶正電（正電荷總數多于負電荷）。 也就是說在任何Ph環境下，蛋白質都同時帶正電荷和負電荷，電荷在標記過程中起著很重要的作用，一是其本身貢獻結合作用力，另一個重要的影響是，標記的前提是蛋白和金在溶液中接觸，而電荷直接影響兩者的接觸，也就是影響標記效率。還有一個隱藏的屬性是，加入蛋白本身對標記Ph有一定的影響（釋放或結合H+），而且其保存液也是一種緩沖液，這個隱藏屬性對標記環境有一定的影響，尤其是放大標記過程。
6.結合的三種作用力： 1）電荷引力： 前面講過，膠體金表面有一圈負電層，蛋白質在標記環境下有一些基團是帶正電荷的，兩者之間通過電荷引力結合。注意，蛋白雖然是通過正電荷與金結合，但是我們調節Ph的目的并不是刻意使蛋白帶正電，如果一個蛋白帶有很多正電基團，這些基團同時吸引結合多個膠體金，這些膠體金再去結合帶正電的蛋白，再結合膠體金……，這樣循環下去，就會形成交聯死金的情況，表現就是低Ph條件標記，膠體金變紫、變藍甚至變黑沉淀。相反我們的目的是使蛋白帶合適的負電荷，不至于與膠體金無限交聯，但是這個Ph也不能太高，太高了蛋白本身正電基團減少，蛋白與膠體金負電斥力增加，兩者很難接觸到一起，表現就是隨著Ph的繼續升高，標記物活性降低，（極端情況下，蛋白負電荷太多，與金完全相斥，不發生結合）。 因此Ph需要在一個合適的范圍，有合適的負電基團保持與膠體金的斥力，維持穩定，同時有足夠多的正電基團與膠體金吸引并結合，保證高的標記效率。 2）疏水作用力： 這種力在免疫反應中的作用最大最強，對于維系復合物穩定起到主要作用，而膠體金與蛋白的穩定吸附也很依賴疏水作用力，如果說之前的電荷引力是相親，第一眼的印象很重要（同性相斥，異性相吸），那么疏水作用力就是領證，維系穩定的婚姻關系（強力、長期），所以對于標記來說，除了Ph外，表活的存在也會嚴重影響標記效率，因此標記時不能加表活，燒金、標記的玻璃器皿也最好別用含表活的洗滌靈清洗。 早期論壇里有一種說法，說調Ph到等電點附近時，折疊在蛋白內部的疏水基團會暴露出來，增加與金的疏水結合。這個說法我沒找到相關的文獻支持，說說我的理解： 論壇這個說法可能是源于蛋白鹽析和等電點沉淀法的原理，蛋白質一般在等電點時溶解度最低，在等電點外的Ph環境下，因為蛋白上面帶同種電荷相斥和水化膜的保護，能夠穩定溶解，但在等電點時蛋白的凈電荷為0，斥力消失，蛋白容易碰撞到一起，因疏水殘基互相結合而析出，如果再加入鹽蓄意破壞水化膜，蛋白就稀里嘩啦的沉淀了。但這些疏水基團并不是在等電點時才由內部露出來的，雖然蛋白的大部分疏水基團折疊在內部，但是仍然有疏水基暴露在水中（數量不一，多的據說有約1/3），也就是在等電點時，沒有了斥力，蛋白表面的疏水殘基容易發揮作用，而不是在等電點時才暴露出疏水基團。 從這里引出的另一點推論是，疏水作用力的發生需要疏水基團空間上足夠靠近，如果有靜電斥力存在，疏水基團碰不到一起，也就發揮不了作用了，這也就是說，標記時Ph過高導至活性降低的原因，一是正電基團減少，電荷引力減弱，另一個靜電斥力太大，疏水作用力很難發揮作用，綜合結果就是結合到金子上的蛋白更少了。 最后要說的是，蛋白的折疊結構確實會受Ph的影響，因為蛋白質的COO-和NH3+這兩種殘基之間會形成電荷引力，這是維持蛋白三維空間構象的一種作用力，不同的Ph條件，會改變蛋白的電離傾向，從而破壞這種作用力，使蛋白質的空間構象發生一定的改變。這種改變帶來什么影響不好說，我們常用的Ph范圍內，抗體構象改變的程度應該并不大。
3）金硫鍵：一個強大的作用力，以下引自濤哥的《桔林雜談（3）—糾結的PI+0.5》。 “為什么我們在實際探索最佳標記PH的時候，有的蛋白最佳標記PH并不符合這個規律？有的蛋白隨著標記PH的升高反而表現出更強的特異性反應，或者特異性反應強度出現拋物線樣的變化，或者······ 我們在解釋PI+0.5時，并沒有引入配價結合參與標記過程的機理。蛋白的半胱氨酸殘基可以通過硫基與膠體金表面形成配位鍵，而這種結合作用力是非常強的，完全可以打亂上述規律。比如一個蛋白的氨基酸序列中含有相對較多的半胱氨酸殘基，而這些殘基分布在序列的多個位置上，牢固的吸附于膠體金表面，這樣蛋白的特異性表位可能很難暴露出來。如果采用較高的標記PH，當斥力占絕對優勢時，蛋白特異性表位將會暴露出來。反應在表觀上，就是在一定范圍內，標記PH越高，特異性反應越強。如果一個蛋白含有非常多的半胱氨酸殘基，由于強大的配位鍵結合力，將會導至金標記物互相吸附，進而凝集、藍變甚至沉淀。這可以解釋，為什么有的抗原純度雖然很高，也不含有干擾成分，但即使采用很高的標記PH，也無法標記成功。將抗原加入膠體金溶液中，即發生藍變。 另外一個典型的可以說明配位鍵對標記效果影響的例子是：硫柳汞，這也是膠體金產品中忌諱該防腐劑的原因。 此時，我們會發現配價結合作用力與其它作用力對標記效果的影響，有時候會產生矛盾，而互相矛盾的作用力共同作用一個反應的時候，可能會出現拋物線樣的性能表象。在拋物線的前后位置，代表了某種作用力更占優勢，而在拋物線的頂端，是各種作用力的平衡點。 在查閱文獻資料的時候，我們還可能會看到一種說法，關于標記蛋白大致可以分為三類：PH非依賴型、PH非嚴格依賴型、PH嚴格依賴型。之所以有這種說法、出現這些現象，與三種作用力的共同作用有關。對于PH非依賴型和非嚴格依賴型往往與蛋白的氨基酸序列中含有相對較多的硫鍵有關。“ 未完待續…… |
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第二話——標記（中）
（二）操作
上面大篇幅都圍繞Ph展開，因此不難想象Ph是標記優化的一個關鍵點，總結起來就4個字——高效、穩定。很多流程里，摸索最佳Ph都是優化標記的第一步，但是如果大家對第一話《燒金》的內容還有印象的話，那么標記的第一步首先應該是找到合適的容器，因為膠體金有潔癖。
1.容器：
推薦用清洗過的西林瓶（玻璃瓶）。因為兩點原因，不推薦用ep管，一是不干凈，你可以做個實驗，拿十幾個離心管，裝好膠體金，其他什么都不加，用力搖晃，會發現金子顏色變化，嚴重的情況是金子直接變深紫、甚至變黑，輕微的情況是金子稍微偏紫一些，這是因為離心管不干凈導至的死金，如果其隨機發生在標記過程中，結果會難以分析。二是容易產生吸附，尤其是在用高倍金（比常用的1/萬濃度高的金）標記重組抗原的時候。
萬一你圖省事，用離心管隨便做做，至少要用超純水多洗幾次，包括與膠體金接觸的槍頭。說到槍，在少量標記時，如果用槍混勻，一定要慢吸慢放，快了的話，金子從槍頭上行接觸到槍末端，一個是對槍不好，再一個金子會死的很難看。
2.最適Ph：
1）取6個玻璃瓶，每個加1ml膠體金（1/萬濃度，也可以做個10個8個的梯度）。
2）分別加入0.2M碳酸鉀0、2、4、6、8、10ul，加入之后馬上、充分混勻。（注意：加進去碳酸鉀要馬上混勻，不然的話，碳酸鉀會自然沉降到底部，導至局部離子強度過大，嚴重的情況會導至底部的金子直接死掉，變成黑色，而上面的金子是正常的紅色，出現明顯的分層現象。）
3）分別加入10ug待標記原料，混勻，反應30min，觀察顏色變化。（標記時間后續需要優化，分析顏色變化有利于了解原理和解決問題）
4）分別加入10%的BSA 100ul，混勻，反應30min。觀察顏色變化。
5）離心，4℃，9000rpm，15min，上清盡量取干凈。（機器不同，金子大小不同會有差異，具體根據離心效果看，上清干凈即可。正常情況下，離心后沉淀蓬松，管壁無沉淀）
6）1/10體積復溶（注意復溶表現，有無不溶顆粒物），噴金6-9ul/cm，與劃好的膜一起組裝檢測，符合性能要求的前提下（或者性能相差不太大的情況下），盡量選擇遠離變色臨界點的條件為最適Ph。
3.討論：
1）一個最佳Ph實驗，需要一個完整的生產、檢驗過程，不要奢望看個顏色，加個NaCl就出結果了，想想我們優化Ph的初衷——穩定、高效，首先是獲得一個穩定的標記物和穩定的生產過程，也就是從頭到尾不死金，再一個就是產品的性能符合要求。
標記物再穩定，產品性能不合格，也是枉然；性能合格，操作重復性或產品穩定性差，也是白瞎。
我們來看一下NaCl滴定為什么不適用（NaCl滴定的原理在第一話中講過，是基于鹽離子對疏水膠體穩定性的破壞作用）。
首先，低標記ph下，蛋白會帶更多的正電荷，金標物之間的斥力會比較小，但這時標記的效率較高，而高標記效率往往是我們追求性能時所需要的，這時我們如果加NaCl進去，會很破壞本就脆弱的斥力，進而出現死金現象，但是在正常操作時我們會用BSA進行封閉，這個封閉不僅能封閉金子表面，更重要的是，他使金標復合物帶了更多的負電荷，使標記物更加穩定。所以，NaCl法沒有考慮到封閉的穩定作用，NaCl滴定不穩定，不代表封閉后也不穩定；再一個，NaCl滴定會誤導我們選擇性能較低的條件（ph偏高一些），當然這也有一點好處，就是選擇高的標記ph條件對放大生產的穩定有利。
上面這種情況是NaCl滴定能夠得以順利實施的情況下表現出的缺陷，在其他一些特殊情況下，NaCl滴定法可能沒辦法實施，比如，標記后的復合物本身斥力足夠大，你又過量標記，加NaCl進去都不變色；又或者金子質量太差，或原料特殊，加進去NaCl所有條件都變色，甚至不加NaCl大部分條件都變色，這時你如果跟隨NaCl的腳步，不一定帶到哪條溝里去了，糾結于此往往不能發現背后真正的原因和解決方法。
對于部分IgG1型的抗體，NaCl滴定選擇的條件會接近性能實驗結果，但即使都是IgG1型抗體，標記、離心時的表現也會有很大差異，所以優化標記應以穩定高效的性能目標為指導，拋棄文獻中的NaCl滴定法。
2）關于調節金子Ph：
常用的是碳酸鉀梯度調節，Ph隨著加入體積的增加而升高，這是一個相對連續的調節方法。有些公司使用緩沖液調節Ph，方法是加入相同體積、不同Ph的緩沖液，比如加入1/20的7.2的PB、8.0的BB、9.6的CB等等，這是一種跨步式的調節方式。兩種方式調節均以加入量為參數，不必糾結具體的Ph數值，當選出最合適條件后，可以想辦法檢測一下這個點的Ph數值，在生產中作為一個質控點。
碳酸鉀調節的優點是可以細化很多Ph梯度，從而利于追求性能，缺點是過于追求性能情況下，在臨界狀態附近放大標記，容易出現死金。
等比例放大，標記的整體Ph環境相同（1ml和幾百ml，操作無錯誤，最終的膠體金Ph是一樣的），那為什么小量標記沒事，放大會死金呢，這是一個比較困惑的問題，可以從兩方面理解（這只是我的推論，有助于理解現象）：
一是“狼多肉少”，膠體金是狼，蛋白是肉，少量標記時，假設在反應中心，1個金子標記上了蛋白，這時在反應區域外有9個等待標記的金子虎視眈眈，他抱著蛋白往外突圍，走一步撞上1個金子，對方說“隊長，別開槍，是我”，原來他走的同時，對方也標記上了蛋白，這時競爭比例變成了2:8，再走一步，比例變成了5:5，他最終突圍出包圍圈后，所有金子都標記好蛋白了，突圍過程很從容，大家誰也不會搶誰的，相安無事。但是放大標記后，他突圍了一層包圍圈，遇到的是新的一批未標記的金子，再次勉強突圍后，迎接他的又是新的一批沒標記的金子，誰也別廢話了，動手吧，最終搶來搶去，一個蛋白連上了多個金子就死金了。也就是放大標記中，整體Ph環境一致，蛋白的結合傾向是一致的，但是從反應中心擴散到整個區域的過程中，一個蛋白需要面對更多的金子的爭搶，所以放大標記比小量標記容易死金。
另一個原因是局部ph降低，加入蛋白意味著引入了緩沖液（蛋白保存液），一般蛋白的保存液是PB，會拉低局部的Ph，放大標記，加入的蛋白保存液量明顯增加，在這個局部反應區域內，蛋白是在低Ph環境下標記，更容易死金。
以上通用的解決辦法就是要把標記Ph提高一些，在臨界狀態之后，性能滿足要求的前提下，盡量往高提，能提高多少視蛋白結構和金子濃度而異。高倍金放大死金的風險遠遠高于常用的1/萬金。
而緩沖液標記放大死金的風險相對較低，可能有兩方面原因，一是本身緩沖對的緩沖能力大于單純的碳酸鉀，二是已經人為的加大了Ph的跨度（相當于碳酸鉀梯度做大了，你選擇的最優點已經是遠離臨界狀態的安全點了）。
3）最適蛋白量：
過程類似，在最適Ph點上，把標記蛋白量做個梯度優化，梯度范圍1ml金子加5-20ug蛋白。
優化標記量是因為免疫反應有比例性，夾心法一般標記量增加，一個金子上面標記上的蛋白就越多，與待測物反應越充分，整個復合物被T線捕獲的機率也越高，靈敏度就越高，這個前提是上清游離原料去除干凈，而這其實并不容易，所以標記濃度高了，游離抗體去除不干凈引起的競爭效應會越明顯，靈敏度反而降低，另外過飽和標記Fc相對隱蔽，對C線顯色也有影響（參照下圖，濤哥形象的畫風）。
而競爭法相反，標記量越低，金子上的抗體越少，與陽性樣本反應后，金子上留給T線的未反應抗體就越少，越利于消線，靈敏度越高。
優化蛋白標記量的主要篩選標準是產品性能，標記多少對金標物穩定的影響不是主要考慮項，所以更用不到NaCl滴定法。
4）封閉：
一般的文獻都會說封閉是為了封閉金子表面的活躍位點，避免層析中出假陽，慢慢會發現除了這點，還有兩個重要作用，一是穩定標記物，二是提供離心環境，這兩個作用出鏡率不及“封閉位點”，但是隨著了解的更加深入，你會發現封閉表面的作用太膚淺了，“穩定標記物”和“提供離心環境”才是最重要的，解決死金的思路都在這里。
首推的封閉劑是BSA，質量很關鍵，濤哥有過長篇論述，不同廠家的BSA，在封閉時會有很大差異，所以，一開始選擇一種好的BSA很重要（好在有人專門賣膠體金產品用的BSA，可以排除BSA廠家的因素，讓你專注其他問題）。
如果操作過程中出現異常，觀察每一步的實驗現象會有助于發現和解決問題，與BSA相關的比如：
質量很好的BSA能夠勝任絕大部分封閉工作，封閉離心復溶一切正常，而質量一般的BSA只能用于一部分標記單抗的封閉，如果標記特殊亞型單抗或者重組抗原，封閉沒問題，但是離心會死金。
另外一些情況是，有些BSA溶解后是酸性的，用他封閉會導至標記蛋白帶正電從而引起死金（可以嘗試用Tris溶解BSA，整體呈堿性），有些BSA含雜質鹽，用他封閉會破壞金標物的斥力從而引起死金。這兩點基本上在封閉時就表現出異常了。
如果你常用的BSA沒有換，標記的抗體也沒有換，離心出現異常，多半是標記Ph和膠體金本身的質量問題。
在這里我想說一下我對BSA封閉機理的推論，我認為其主要作用力就是金硫鍵。BSA等電點4.7，我們標記時的Ph遠大于其等電點，為什么一般情況下，我們標記抗體或抗原時，別說遠遠高于了，就是一般的高于等電點，標記后活性都大打折扣（標記效率極低），但是這個BSA封閉，無論什么Ph都能很好封閉膠體金裸露位點，而且還是人家抗體不愿意（難）結合的剩余位點，雖然BSA過量是一個因素，但是如果是很高的標記Ph，過量的蛋白進行標記也是浪費。不否認BSA渾身負電，仍有正電基團，但是Ph遠遠高于等電點，正電基團數量少得可憐，所以正負電荷引力難堪重任，甚至相互吸引接觸都成問題。如果說主要靠疏水，在強大斥力存在時，疏水基團碰撞結合的幾率也很低，那為什么其他蛋白遠離等電點時，疏水結合很難起作用，但BSA卻能很好結合？
所以最后只有一種可能，就是金硫鍵，BSA有581（也有說583）個氨基酸殘基組成，分子量66.4KD，其中有35個半胱氨酸，組成了17個二硫鍵，在肽鏈的第34位還有一自由巰基。這個自由巰基很容易與膠體金形成共價結合，而且共價結合力遠遠強于靜電和疏水，同時他不受Ph條件的影響，并且共價鍵具有飽和性，所以一個BSA只能通過一個自由巰基結合一個膠體金，不會引起金子的聚集，但是一個膠體金可以結合多個BSA，所以封閉后的金標物帶有更多負電荷，能夠更穩定、更分散。
實驗現象表明BSA的加入，會讓某些輕微變紫色的金子回復成紅色，這是本已聚集的膠體金顆粒重新分散的表現，這說明BSA在封閉時有很強的負電斥力，并且很高效的結合到了膠體金上，與上面的推論相吻合。
所以我認為，金硫鍵是BSA封閉膠體金時的主要作用力。關于BSA的封閉機理，每個人會有各自的看法，至少目前沒有統一的定論，這只是我根據幾種作用力的原理及實驗現象得出的推論，大家看看就行，反正不知道原理，直接用也不會有問題。
另外一個常用的封閉劑是酪蛋白，比BSA保護作用更強，甚至標記時已經死了的金都能安全離心，這是一件好事，也是一件頭疼的事，可以慢慢體會。但是剛接觸一個項目的時候，不建議用酪蛋白封閉，如果對反應體系不了解，酪蛋白封閉容易篩選出有缺陷的原料，從而引發一系列意想不到的問題。常見的降低靈敏度、產品特異性缺陷，罕見的金子釋放異常等。
未完待續……
第二話——標記（下）
5）離心純化：
目的有幾方面：去除游離蛋白；置換儲存液；濃縮。高速離心，本身是一個加速破壞的過程，所以離心需要平衡兩點，“上清干凈”和“無不溶顆粒”，這兩個矛盾的問題在小量離心時不明顯，但是大量離心就講究了，以下引自濤哥答疑錄：
“關于金標記物的離心方法，五花八門，各種各樣的都有，比如：有人先低速離心，去掉大顆粒沉淀，再高速離心，去掉上清；有人直接一步離心，去掉上清；有人梯度分步離心，離心三次；有人梯度分步離心，離心兩次。具體需要采用哪種離心方法，跟金的質量、 標記物質、體積、顆粒大小都有關系。梯度分步離心，轉速是逐步升高的，舉個例子：比如一步離心某個金標記物，需要10000rpm 離心2小時才能離心徹底，梯度分步離心可以這么做，6000rpm 離心半小時，分離上清和沉淀，8000rpm 離心半小時，分離上清和沉淀，12000rpm 離心，直至上清清澈，去掉上清，將三次沉淀混合復溶。這么做是為了避免最先離心下來的金標記物，被長時間高速擠壓而聚集。”
6）復溶：
很多新人一上來喜歡要配方（這情有可原，因為新手對體系沒有概念，不知道各種物質的作用，很難下手），而很多老司機討厭直接要配方（這也沒錯，因為做的項目多了，多少都會有針對性的調整，一張配方吃天下是很難的，拿到原料都會先摸一下脾氣，再針對性調整，所以從心里抵觸那種重配方輕實踐的思想）。
我們懸浮金子，首先要保持金標物液態穩定，然后是干燥過程中穩定，然后是干燥后穩定并且充分釋放，我在這里從理論上介紹一個基礎配方，再簡單介紹幾個常見的使用物質的添加思路：
我們先看一個基礎配方：0.01MTris-HCl Ph8.5+1%BSA+10%蔗糖。
首先是緩沖液：金標物標記的是蛋白，蛋白需要保存在緩沖體系中，所以我們需要一種緩沖基質，而標記中我們講了Ph對蛋白電荷的影響，雖然已經標記并且封閉了，但是低Ph使蛋白帶更多正電荷，仍然會導至金標物交聯死金，所以我們需要較高的Ph，這是我們不用7.2的PB的原因；太高的Ph又會使蛋白與金的電荷斥力增大，有脫落的風險，所以Ph又不能太高，最終Ph8.5的Tris緩沖液脫穎而出，大部分單抗的等電點在8.2，8.5這個Ph可以保證標記抗體帶少量負電荷維持標記物整體穩定，對于等電點不確定的重組抗原，Tris這個緩沖基質也完全勝任。離子本身對金標物有破壞作用，所以我們用很低的摩爾濃度，更不會主動添加NaCl（需要的話，一般是加在樣品墊或者樣品緩沖液中）。
然后是BSA： BSA有幾個作用，一是高濃度雜蛋白的存在，有利于保護標記蛋白；二是用高濃度BSA封閉金墊，金墊上如果有易吸附蛋白的位點，就讓他吸附BSA，從而使金標物能夠順利釋放出去；三是流動封閉NC膜，NC膜通過電荷和疏水兩種作用，極易吸附金標物，產生層析不干凈、T線反白等異常問題，而BSA在層析過程中，一邊流動一邊對NC膜進行封閉（所謂的流動封閉），可以明顯改善這種異常現象；四是BSA可以對蛋白之間的非特異反應起到一定的封閉作用。
最后是糖：糖作為一種干燥保護劑，阻止蛋白在干燥過程中變性（兩種假說，代替水化膜保護氫鍵和結合水，形成玻璃態保持蛋白三維構象），他可以提供一個相對親水的環境，避免金標物通過疏水作用與金墊牢固結合。所以穩定性（長期或加速）出現金子不釋放的情況，多半是沒有加糖，金子上蛋白與金墊發生了牢固吸附導至的。另外金子吸潮后也會出現釋放困難的問題，而糖加多了對濕度更敏感，所以一般加10-20%。
這是一個基礎配方，組成的思路就是這樣，基本上可以通用了。我們搞配方，不是打網游，基礎不等于白字裝備，而動輒7、8個、十幾個成分的配方也等于牛逼的橙色史詩裝備，他一般都是特事特行，根據需要調出來的，是一個無奈的產物，正常的配方就應該宜簡不宜繁，越簡單適用性越廣，越容易控制，出問題也越容易分析。
下面簡單介紹一下其他添加其他物質，比如：
表面活性劑（吐溫）：促進釋放的作用，但是物理吸附中疏水作用占很大比例，在液相中如果表活濃度過高，金標蛋白有脫落風險。另外，有吐溫的存在，干燥后吸潮的風險大大增加，對環境濕度的要求更高。所以還是盡量少加，而且含表活的金標物盡量不要液態長時間存放。
高分子聚合物（PVP、PEG）：本身對釋放有一定的促進作用，而且可以促進反應，但是引起非特異性反應的風險也較高。另外加在金墊中，在干燥過程中會迫使金標蛋白相互聚合，從而形成大的顆粒，正面作用是提高了靈敏度，負面作用是容易出假陽，而且在某些時候引起顆粒過大，在NC膜底部會出現不能順利層析的顆粒物。
酪蛋白：在某些情況下，有促進金子釋放的作用，一般用不到。另外對蛋白間的非特異反應有很強的封閉作用，但是其本身對正常的免疫反應的封閉作用也很強，所以視情況而加。
海藻糖：對蛋白的保護作用強于蔗糖，成本相對較高，如果金子穩定性有問題，尤其是加速穩定性出問題，可以再加點海藻糖。
7）金墊：
材質常用的有幾種，包括玻纖、聚酯和無紡布。沒有誰好誰不好的說法，主要選擇依據是均一性，其他的根據自身需要來選擇，比如厚度、承載量、釋放速度（一般聚酯的釋放速度快于玻纖）等。不同材質、型號的金墊，有些可能需要前處理，如果能夠正常鋪金、正常釋放，一般直接用也沒啥大問題。
4.質量檢驗：
檢驗成功標記的方法只有組裝成品，進行性能測試這一種方法。
除了死金等異常外，常見的失效模式有兩種，一是沒有標記上（廢話），二是標記后沒有活性或者活性不達標，這兩點通過性能檢測一步到位。
通常文獻中介紹的分光光度計掃描法，會有最大吸收峰右移的現象，這只能說明標記上了東西（粒徑增大），但是即使沒標記上目標原料，BSA的封閉也會稍微增大粒徑的，況且成功標記上原料，性能不達標也是白瞎，所以這個不能用作金標物的質量檢驗。
但是分光光度法掃描也不是沒有用處，可以用作控制復溶比例（金標物濃度）的一個指標。而且引申一下，最大吸收峰右移現象，可以幫助我們分析標記物沒活性的原因（對比正常的標記結果，看右移現象及程度，可以知道這個失效是沒標記上，還是標記了但沒活性。這一點是我的猜測，沒實際用過，因為物理吸附很少出現這種情況，而共價標記中buffer選擇不合適，標記不上的現象會很常見，測粒徑變化可以幫助我們分析標記結果）。
