5）離心純化：
目的有幾方面：去除游離蛋白；置換儲存液；濃縮。高速離心，本身是一個加速破壞的過程，所以離心需要平衡兩點，“上清干凈”和“無不溶顆粒”，這兩個矛盾的問題在小量離心時不明顯，但是大量離心就講究了，以下引自濤哥答疑錄：
“關于金標記物的離心方法，五花八門，各種各樣的都有，比如：有人先低速離心，去掉大顆粒沉淀，再高速離心，去掉上清；有人直接一步離心，去掉上清；有人梯度分步離心，離心三次；有人梯度分步離心，離心兩次。具體需要采用哪種離心方法，跟金的質量、 標記物質、體積、顆粒大小都有關系。梯度分步離心，轉速是逐步升高的，舉個例子：比如一步離心某個金標記物，需要10000rpm 離心2小時才能離心徹底，梯度分步離心可以這么做，6000rpm 離心半小時，分離上清和沉淀，8000rpm 離心半小時，分離上清和沉淀，12000rpm 離心，直至上清清澈，去掉上清，將三次沉淀混合復溶。這么做是為了避免最先離心下來的金標記物，被長時間高速擠壓而聚集。”
6）復溶：
很多新人一上來喜歡要配方（這情有可原，因為新手對體系沒有概念，不知道各種物質的作用，很難下手），而很多老司機討厭直接要配方（這也沒錯，因為做的項目多了，多少都會有針對性的調整，一張配方吃天下是很難的，拿到原料都會先摸一下脾氣，再針對性調整，所以從心里抵觸那種重配方輕實踐的思想）。
我們懸浮金子，首先要保持金標物液態穩定，然后是干燥過程中穩定，然后是干燥后穩定并且充分釋放，我在這里從理論上介紹一個基礎配方，再簡單介紹幾個常見的使用物質的添加思路：
我們先看一個基礎配方：0.01MTris-HCl Ph8.5+1%BSA+10%蔗糖。
首先是緩沖液：金標物標記的是蛋白，蛋白需要保存在緩沖體系中，所以我們需要一種緩沖基質，而標記中我們講了Ph對蛋白電荷的影響，雖然已經標記并且封閉了，但是低Ph使蛋白帶更多正電荷，仍然會導至金標物交聯死金，所以我們需要較高的Ph，這是我們不用7.2的PB的原因；太高的Ph又會使蛋白與金的電荷斥力增大，有脫落的風險，所以Ph又不能太高，最終Ph8.5的Tris緩沖液脫穎而出，大部分單抗的等電點在8.2，8.5這個Ph可以保證標記抗體帶少量負電荷維持標記物整體穩定，對于等電點不確定的重組抗原，Tris這個緩沖基質也完全勝任。離子本身對金標物有破壞作用，所以我們用很低的摩爾濃度，更不會主動添加NaCl（需要的話，一般是加在樣品墊或者樣品緩沖液中）。
然后是BSA： BSA有幾個作用，一是高濃度雜蛋白的存在，有利于保護標記蛋白；二是用高濃度BSA封閉金墊，金墊上如果有易吸附蛋白的位點，就讓他吸附BSA，從而使金標物能夠順利釋放出去；三是流動封閉NC膜，NC膜通過電荷和疏水兩種作用，極易吸附金標物，產生層析不干凈、T線反白等異常問題，而BSA在層析過程中，一邊流動一邊對NC膜進行封閉（所謂的流動封閉），可以明顯改善這種異常現象；四是BSA可以對蛋白之間的非特異反應起到一定的封閉作用。
最后是糖：糖作為一種干燥保護劑，阻止蛋白在干燥過程中變性（兩種假說，代替水化膜保護氫鍵和結合水，形成玻璃態保持蛋白三維構象），他可以提供一個相對親水的環境，避免金標物通過疏水作用與金墊牢固結合。所以穩定性（長期或加速）出現金子不釋放的情況，多半是沒有加糖，金子上蛋白與金墊發生了牢固吸附導至的。另外金子吸潮后也會出現釋放困難的問題，而糖加多了對濕度更敏感，所以一般加10-20%。
這是一個基礎配方，組成的思路就是這樣，基本上可以通用了。我們搞配方，不是打網游，基礎不等于白字裝備，而動輒7、8個、十幾個成分的配方也等于牛逼的橙色史詩裝備，他一般都是特事特行，根據需要調出來的，是一個無奈的產物，正常的配方就應該宜簡不宜繁，越簡單適用性越廣，越容易控制，出問題也越容易分析。
下面簡單介紹一下其他添加其他物質，比如：
表面活性劑（吐溫）：促進釋放的作用，但是物理吸附中疏水作用占很大比例，在液相中如果表活濃度過高，金標蛋白有脫落風險。另外，有吐溫的存在，干燥后吸潮的風險大大增加，對環境濕度的要求更高。所以還是盡量少加，而且含表活的金標物盡量不要液態長時間存放。
高分子聚合物（PVP、PEG）：本身對釋放有一定的促進作用，而且可以促進反應，但是引起非特異性反應的風險也較高。另外加在金墊中，在干燥過程中會迫使金標蛋白相互聚合，從而形成大的顆粒，正面作用是提高了靈敏度，負面作用是容易出假陽，而且在某些時候引起顆粒過大，在NC膜底部會出現不能順利層析的顆粒物。
酪蛋白：在某些情況下，有促進金子釋放的作用，一般用不到。另外對蛋白間的非特異反應有很強的封閉作用，但是其本身對正常的免疫反應的封閉作用也很強，所以視情況而加。
海藻糖：對蛋白的保護作用強于蔗糖，成本相對較高，如果金子穩定性有問題，尤其是加速穩定性出問題，可以再加點海藻糖。
7）金墊：
材質常用的有幾種，包括玻纖、聚酯和無紡布。沒有誰好誰不好的說法，主要選擇依據是均一性，其他的根據自身需要來選擇，比如厚度、承載量、釋放速度（一般聚酯的釋放速度快于玻纖）等。不同材質、型號的金墊，有些可能需要前處理，如果能夠正常鋪金、正常釋放，一般直接用也沒啥大問題。
4.質量檢驗：
檢驗成功標記的方法只有組裝成品，進行性能測試這一種方法。
除了死金等異常外，常見的失效模式有兩種，一是沒有標記上（廢話），二是標記后沒有活性或者活性不達標，這兩點通過性能檢測一步到位。
通常文獻中介紹的分光光度計掃描法，會有最大吸收峰右移的現象，這只能說明標記上了東西（粒徑增大），但是即使沒標記上目標原料，BSA的封閉也會稍微增大粒徑的，況且成功標記上原料，性能不達標也是白瞎，所以這個不能用作金標物的質量檢驗。
但是分光光度法掃描也不是沒有用處，可以用作控制復溶比例（金標物濃度）的一個指標。而且引申一下，最大吸收峰右移現象，可以幫助我們分析標記物沒活性的原因（對比正常的標記結果，看右移現象及程度，可以知道這個失效是沒標記上，還是標記了但沒活性。這一點是我的猜測，沒實際用過，因為物理吸附很少出現這種情況，而共價標記中buffer選擇不合適，標記不上的現象會很常見，測粒徑變化可以幫助我們分析標記結果）。