鹽析法（saltingoutmethod）分析測定血清白蛋白和球蛋白

[目的與原理]
掌握血清白蛋白和球蛋白測定的原理和方法，并用鹽析法測定水產動物血清中白蛋白和球蛋白的含量。
血清中含有多種不同成分的蛋白質，主要為白蛋白和球蛋白。用鹽析法沉淀血清中球蛋白，用雙縮脲法測定上清液中白蛋白，同時測定血清總蛋白。血清球蛋白的量從兩者的差值求得。
[試劑與器材]
試劑：
1、球蛋白沉淀劑：稱取硫酸鈉（Na2SO4）208g，及亞硫酸鈉（Na2SO3）70g，加入蒸餾水約900ml，并加入濃硫酸2ml，使蒸餾水酸化。不停攪拌，待完全溶解后將溶液移入1L容量瓶內，用蒸餾水稀釋至1L刻度。保存于25℃以上的溫度中。
2、雙縮脲試劑
3、標準血清：市售或配制。
4、乙醚
器材：
可見分光光度計，離心機， 試管若干及試管架，旋渦混合器，塑料試劑瓶，1L容量瓶，燒杯 2個，吸管若干支，濾紙，擦鏡紙。
[實驗步驟]
1、準確吸取血清樣本0.2ml，置于10×100mm試管內。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀劑3.8ml，塞住管口，反復倒轉混和10次（不宜過多）。以1ml刻度吸管吸取懸液1ml（相當于血清0.05ml），置于另一試管內，作為“總蛋白測定管”。剩余的混懸液另加乙醚約2ml，撳住管口，在約20秒鐘內顛倒混和40次，然后經每分鐘2500轉的速度離心沉淀5分鐘。此時試管內分成三層：上層為乙醚，中層為球蛋白，下層為澄清的白蛋白溶液。將試管斜置在桌面片刻或輕擊試管，待蛋白塊自管壁分離后，將1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，準確，且不可觸及球蛋白塊片）。取出吸管，用濾紙拭去管尖可能附著的球蛋白沉淀，將白蛋白溶液加入另一試管內，作為“白蛋白測定管”。在另一試管內加入標準血清0.2ml及球蛋白沉淀劑 3.8ml，混和后準確吸取混懸液1ml，加入一試管中作為“標準管”。再取一試管加球蛋白沉淀1ml，作為“空白管”‘
2、每管中各加入雙縮脲試劑4毫升，充分混和后置室溫暗處30分鐘，用540nm或綠色濾光片進行比色，以空白管校正光密度到0點，讀取各管光密度讀數。
3、計算
將所測得的光密度讀數按下列公式計算出白、球蛋白含量及其比值：
（1）總蛋白測定管光密度 / 標準管光密度×標準血清蛋白濃度（g /100ml）＝血清總蛋白g/100ml
（2）白蛋白測定管光密度 /標準管光密度×標準血清蛋白濃度（g/100ml）＝血清白蛋白g /100ml
（3）血清總蛋白—血清白蛋白＝血清球蛋白g/100ml
（4）血清白蛋白&pide;血清球蛋白＝血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）
4、標準曲線繪制：同血清（漿）總蛋白測定雙縮脲法
但用球蛋白沉淀劑代替生理鹽水作為標準血清的稀釋劑。
[方法評估]
本方法采用鹽析法定量測定白蛋白和球蛋白的，用硫酸鈉和亞硫酸鈉分離血清白、球蛋白，所得結果與電泳法相符合。但由于鹽類濃度較高，操作需在較高的溫度下進行，否則將有結晶析出。在25℃操作時，無結晶析出。用亞硫酸鈉作為沉淀劑除可在較低的溫度操作外，還有另一個優點，即它具有緩沖作用。亞硫酸鈉溶液呈堿性，其pH值高于所有血清蛋白的等電點，使各蛋白質均帶有相同的電荷，這將有利于它們的分離。血清經鹽析分離后, 蛋白質的測定一般均用比色法.
[應用意義]
白蛋白和球蛋白的量是按魚種不同而有所變化，一些魚白蛋白＞球蛋白，另一些魚白蛋白＜球蛋白，白蛋白與球蛋白的成分按性別、年齡、成長、季節的變化，營養不良、饑餓、應激刺激等所發生變化。
[注意事項]
1、某些用乙醚及離心沉淀不易得到白蛋白澄清液的標本，在加入球蛋白沉淀劑后，可不加乙醚，而用優質小張中速濾紙在 37℃水浴箱中反復過濾多次，最后可獲得澄清液作白蛋白測定，必要時可按1﹕20比例擴大血清及球蛋白沉淀劑用量。
2、本法測定結果與電泳法相符合，但操作須在25℃以上的室溫中進行。如受實驗室條件限制，只能在較低的溫度下進行測定時，可改用鹽濃度較低的球蛋白沉淀劑（其它試劑及操作方法均與本法相同），但測定結果白蛋白值較本法略高。常用的低濃度球蛋白沉淀劑為23％硫酸鈉溶液（無水硫酸鈉230g，加蒸餾水至1L）或21％亞硫酸鈉溶液（無水亞硫酸鈉210g,加蒸餾水到1L）。