1．目的
學會DNA片段的體外連接技術。
2．原理
在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯接成重組DNA分子。
3．器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴。
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
4．試劑
pUCm-T 載體，Pinpoint?xa-3酶切載體，CHI插入片斷，T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無菌ddH2O。
5．實驗準備
1.5ml離心管裝入飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；平板培養基（含Amp）。
6．操作步驟
1）PCR產物與pUCm-T載體直接連接：
（1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設定在14～16°C。
（2） 取一個滅菌的0.2ml微量離心管，加入：
4μl PCR 產物混合液
1μl pUCm-T載體
0.5μl T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）
1μl 連接酶緩沖液
3.5μl ddH2O
總量 10μl 體系
（3） 上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16°C水中保溫過夜。
（4） 連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4°C冰箱備用。
2）DNA回收片斷（CHI）與載體（Pinpoint?xa-3）連接：
（1） 取一個滅菌的0.2ml微量離心管，加入
4μl 回收DNA片斷
1μl 酶切后回收的載體
0.5μl T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）
1μl 連接酶緩沖液
3.5μl ddH2O
總量 10μl 體系
（2） 上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16°C干式恒溫儀（或16°C水中）中保溫過夜。
（3） 連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4°C冰箱備用。