直接ELISA法

發布時間：2020-09-21 22:05 原文鏈接：直接ELISA法

實驗概要

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

實驗步驟

1. 包被抗原

1) 用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20 μg/ml。用移液器吸取 50 μl 稀釋抗原到 PVC 酶標板上，按要求往后進行系列稀釋。

2) 酶標板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時，或者 4 °C 過夜。孵育時間需要優化。

3) 倒掉孵育溶液，用 PBS 洗板 2 次，每孔 200 μl。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

2. 封閉

1) 用含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標板上剩余的蛋白結合位點，每孔 200 μl。或者用其他封閉劑如 Block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。

2) 封口膜覆蓋酶標板室溫至少孵育 2 小時，或者 4 °C 過夜。

3) PBS 洗板 2 次。

3. 加抗體孵育

1) 加入抗體，每孔 100 μl，稀釋到最佳濃度（參照廠家推薦），使用前用封閉液現配。

2) 封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 2 小時，孵育時間需要進行優化。通常 2 小時孵育即可獲得足夠強的信號，但如果獲得的信號較弱時，可4 °C 孵育過夜獲得較強信號。