活細胞和未染色的生物標本，因細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波通過時，各物點對光的吸收程度不同，在顯微鏡視場中可見到灰度（即明暗度）不同的各物點圖像，這是由于光的振幅不同所致。
如果標本中的物體近乎透明，視場中就看不出明顯的灰度差別。但由于各種物點對光波產生了衍射和折射，使得通過的光波因延遲而發生了偏離，其光程就有了一定的差別，即產生了所謂“位相差”。人眼不能分辨這種位相差，但可以設法將這種位相差轉換成振幅差。相差顯微鏡就是利用光的干涉原理，將位相差轉換成振幅差（即明暗差）的顯微鏡裝置。