真核細胞結構組分的差異去垢劑分離實驗

差異去垢劑分離法（differentialdetergentfract10nat10n,DDF)包括使用一系列含不同去垢劑的PIPES緩沖液對細胞進行連續抽提，首先是毛地黃皂苷，其次是Triton,最后是Tween/脫氧膽酸鹽。這些步驟產生4種在生化和電泳上相異的組分(見圖3.3和表3.7)。包括：

①胞質蛋白和可抽提的細胞骨架組分。用鎂沉淀的方法可以從這個組分中初步

純化出微管組分（見本方案的附加方案：用鎂沉淀微管蛋白和微管結合蛋白）。

②膜和細胞器蛋白。使用TritonX-114可以富集完整的

③核膜蛋白和可抽提的核蛋白。

④抗去垢劑的細胞骨架纖維和核基質蛋白。骨架結合蛋白及其相互作用可進一步用不同濃度的脲來抽提、分析。

懸浮或單層細胞培養物

去垢劑提取緩沖液 PBS 丙酮 裂解緩沖液

離心機 冷凍干燥機

細胞制備

①在冰上預冷細胞培養物，然后用冰浴的鹽溶液、PBS或其他的非變性緩沖液洗2?3次。保存1份洗滌緩沖液（貯存在-70℃)以備將來進行樣品校正，或用于酶、蛋白或RNA分析的對照材料。

②選擇下面合適的方法來處理懸浮液或單層培養物。處理懸浮培養物：懸浮培養的細胞所需的DDF體積取決于細胞的濕重或細胞數量。

a.轉移一小管懸浮培養物到已稱重的塑料小管中，然后短暫地離心；

b.倒出培養基，并稱出細胞沉淀的濕重；

c.進行懸浮細胞的去垢劑分離部分的第①步。

處理單層培養物：單層培養物所需DDF的體積取決于培養細胞的平面區域的大小或細胞數量。

a.測出培養瓶或培養皿的表面積，或是計算一個有代表性的培養皿中細胞的數目；

b.進行單層細胞培養物的去垢劑分離部分的第①步。

懸浮細胞的去垢劑分離

通過連續地加入和去除DDF緩沖液來操作DDF，所有的提取過程都是在冰上進行，并溫和地攪動。注意提取次數對重復性是很重要的。提取物在用于實驗前應一直放在冰上，或冰凍保存（最好是-70℃)。測出每一種去垢劑提取物的回收體積，并計算凈產量或分布百分比。每一種DDF緩沖液，都應保存一小管，以備將來進行樣品校正，或用于實驗的對照材料。

①每克（濕重）洗過的細胞沉淀中加入5倍體積冰冷的毛地黃皂苷提取液緩沖液。溫和地旋轉，重懸細胞沉淀。

②冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動，直到被通透化（permeabilized)的細胞達95%?100%(約10min)(用臺盼藍染色排除法估計）。

實驗提示：在不同組分分離之間保持提取次數的一致是非常重要的。

③480g離心提取混合物10min。

④轉移上清到另一干凈的試管中。測定上清（胞質組分）的體積后，把胞質組分分裝到幾個小管中，并把它們存在-70℃條件下。此為CYTO組分（見圖3.3和表3.7)。

⑤用5倍沉淀體積（相對于細胞沉淀的最初重量)的冰浴TritonX-10O提取緩沖液仔細地重懸毛地黃皂苷不溶的沉淀，以獲得均一的懸浮液。在DDF這一方案中，TritonX-114可以替代TritonX-100，雙向凝膠電泳分析提取組分的結果表明二者沒有明顯的區別。相對于TritonX-100,TritonX-114具有更低的熔點（TritonX-100熔點為60℃;TritonX-114熔點為20℃)，并在非變性溫度下可以將樣品分為高脂相（lipid-rich phase)和低脂相（lipid-poor phase),因而可以對膜整合蛋白和膜外周蛋白，以及可溶的細胞器內含物進行亞組分分離。

⑥冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動細胞30min。

⑦5000g離心提取混合物10min。

⑧轉移上清液至另一個干凈試管中，測量上清液（膜、細胞器組分）的體積，分裝后在-70℃條件下貯存。此為MO組分（見圖3.3和表3.7)。

⑨Triton提取殘渣用Tween-40/脫氧膽酸鈉提取緩沖液重新懸浮，其體積為Triton提取（第⑤步）時所用體積的1.5倍。使用特氟隆（Teflon)滑壁玻璃勻漿器(smooth-walled glass homogenizer)，以中等速度研磨介質5次，使沉淀重新懸浮。

⑩6780g?離心抽提混合物10min。

?轉移上清液至另一個干凈試管中，測量上清液（核組分）的體積，分裝核組分后于-70℃條件下貯存。此為NUC組分（見圖3.3和表3.7)。

?將含有1.2mmol/L PMSF的冰浴PBS(pH7.4)加到抗去垢劑沉淀中，使用Tef10n研磨3次以重懸沉淀，然后12000g離心10min,收集沉淀。

?重復步驟?兩次以上，以徹底清洗沉淀。

?去上清，用90%丙酮（-20℃預冷）洗沉淀一次。

?過夜凍干沉淀（細胞骨架/核基質組分）。

?在已知重量的離心管中測出沉淀的重量，于-70℃條件下貯存樣品。此為CSK/MAT組分（見圖3.3和表3.7)。

通常情況下細胞懸浮液的CSK/MAT組分的產率很高。因而，貯存冷凍干燥的沉淀組分更為方便，用時只需用非變性的細胞骨架溶解緩沖液來重懸已測定過重量的沉淀。

?進行蛋白濃度的測定部分的操作。

單層細胞培養物的去垢劑分離

通過連續地加人和去除DDF緩沖液對DDF進行操作。所有的提取過程都是在冰上進行的，并溫和地攪動。注意提取次數對重復性是重要的。實驗前，提取物應維持冰浴，或冰凍保存（最好是-70℃)。測出每一組去垢劑提取物的回收體積，并計算凈產量或分布的百分比。每一種DDF緩沖液要保存一小管以作隨后的樣品校準或作為實驗的對照材料。

①直接加1ml冰浴的毛地黃皂苷提取緩沖液到T-25培養瓶中的單層培養細胞上。典型的T-25培養瓶能容納約5X10⁶個細胞。T-75培養瓶或100mm培養皿應加人3ml的毛地黃皂苷提取緩沖液。

②冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動細胞懸浮液，直到95%?100%的細胞被通透化（約10min)(用臺盼藍染色排除法[Trypanblueexclus10n]檢測）。

實驗提示：維持不同組分分離的提取次數的一致性是非常重要的。③傾斜培養瓶，將液體（胞質組分）倒入一個小的培養會。殘余溶液用吸管轉移入培養管中。測定胞質組分的體積，分裝后在-70℃條件下貯存。此為CYTO組分（見圖3.3和表3.7)。

④每個T-25培養瓶（約5X106個細胞）中加入ImlTriton提取緩沖液。在DDF這一方案中，TritonX-114可以替代TritonX-100，雙向凝膠電泳分析提取組分的結果表明二者沒有明顯的區別。相對于TritonX-100,TritonX-114具有更低的熔點（TritonX-100熔點為60℃;TritonX-114熔點為20℃),并在非變性溫度下可以將樣品分為高脂相（Hpid-rich phase)和低脂相（lipul-poorphase),因而可以對膜整合蛋白和膜外周蛋白，以及可溶的細胞器內含物進行亞組分分離。

⑤冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動細胞30min。

⑥傾斜培養瓶，將液體（膜和細胞器組分）到入一個小培養管中，殘余溶液用吸管轉移人培養管中。測定該組分的體積，分裝后在-70℃條件下貯存。此為CYTO組分（見圖3.3和表3.7)。

⑦每個T-25培養瓶（約5X10⁶個細胞）中加入0.5?1.0ml Tween-40/脫氧膽酸鈉提取緩沖液體來提取單層細胞。

⑧傾斜培養瓶，將液體（核組分）到入一個小培養管中，殘余溶液用吸管轉移入培養管中。測定核組分的體積，分裝后在-70℃條件下貯存。此為NUC組分（見圖3.3和表3.7)。

⑨用PBS在原位浸沒單層細胞。

⑩向培養瓶中加入1?3ml的無β-巰基乙醇的非變性細胞骨架溶解緩沖液，對抗去垢劑殘渣進行提取。傾晃培養瓶以懸浮殘渣。測量體積（細胞骨架和基質組分），分裝后在-70℃條件下貯存。此為CSK/MAT組分（見圖3?3和表3?7)。非變性細胞骨架溶解緩沖液的體積取決于細胞類型和培養時間（即胞外基質的量）。一般，1?3ml是合適的范圍。

?進行蛋白濃度的測定部分的操作。

蛋白濃度的測定

①在冰上融化去垢劑緩沖液和提取物。

②用水稀釋毛地黃皂苷/EDTA和Triton/EDTA提取物（對于懸浮培養物的提取物加入4倍體積的水，單層培養物的提取物中加人2?3倍體積的水）。Tween/DOC提取物則不用稀釋。

③在無β-巰基乙醇的細胞骨架溶解緩沖液中溶解冷凍干燥的CSK/MAT沉淀。每10mg(干重）沉淀使用1ml緩沖液。如果需要可以對單層培養物的CSK/MAT進行稀釋。

④每個樣品取20?50μL，用BCA方法測定，重復兩次。另一種測定蛋白質濃度的方法是Peterson的福林（Folin)-酸法，該方法對于去垢劑的干擾不敏感。建議不使用標準的10wry方法，因為在實驗中會有由垢劑誘導的凝聚發生。

使用雙向凝膠電泳分析蛋白質組分

不同細胞類型的DDF樣品可用于二維PAGE分析，包括IEF和非平衡pH梯度電泳（non-equilibrium pH gradient electrophoresis, NEpHGE)。新鮮的或融化的DDF提取物（置于冰上）首先要標準化，使蛋白含量相同，然后添加固體脲至終濃度9.5mol/L。

① 于10μL的樣品，加入85mg脲和15μL 10×0’Fairell裂解緩沖液，加熱至室溫作用。

② 于干燥的CSK提取物，可在1×O’FarreIl裂解緩沖液中直接溶解。

③ 于非還原SDS緩沖液中的CSK提取物，通過加入固體脲和加入10×o’Farrell裂解緩沖液，至終濃度9.5mol/L。加固體脲和10×O’Farrell裂解緩沖液，以便盡可能地減少由稀釋帶來的影響，并盡可能地檢測低豐度蛋白。稍微加熱樣品有利于脲的溶解，但是避免過熱（增加溫度/或延長加熱時間），否則可能會導致人為的氨基甲酰化。

④使用2D電泳分析DDF樣品。

⑤LEF凝膠含有3.5%兩性電解質（2%對應PH5?8，1%對應pH3?10，0.5%對應pH2?5)，樣品需要電泳9800V.h,其中在最后1個小時用800V聚焦。

⑥NEpHGE凝膠含有2%兩性電解質（PH3?10)，樣品需電泳2400V?h。通常在15?60μL的樣品含量達到25?100μg的蛋白，就足以通過考馬斯亮藍或放射自顯影觀察到；低豐度蛋白可通過銀染檢測到。實驗表明，樣品中的去垢劑緩沖液的體積多少不會對IEF凝膠pH梯度的線性范圍產生不利的影響。但是，含有Tween/DOC的樣品可能引起向低pH的輕微漂移。