【原理】
引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產物。其缺點是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5'端多合成2—3個堿基以利于限制性內切酶與PCR產物末端的穩定結合。
本實驗用內切酶將T-GFP質粒的GFP cDNA切割下來，與用同樣內切酶消化的pcDNA3.1連接，構建真核表達載體pcDNA3.1-GFP。
【試劑】
1.菌種含綠色熒光蛋白重組子T-GFP質粒
2.LB液體培養基稱取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加雙蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH調至pH7.4，定容至300ml，轉移至三角燒瓶中，以103.4Kpa高壓滅菌20min。
3.10mg/ml氨芐青霉素(Amp)溶液在無菌條件下配制，－20℃貯存備用。
4.含Amp的LB固體培養基每100mlLB培養液在臨高壓滅菌前加入1.5g瓊脂，以103.4KPa高壓滅菌20min，溶液尚未完全冷卻時，即應取出培養基，并輕輕搖動以使瓊脂均勻分布于整個培養基中。必須小心，此時培養基溶液可能過熱，旋動液體會發生暴沸。應使培養基降溫至50℃(用手背碰一下瓶壁不致燙手)，方可加入Amp，按每100ml培養基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其終濃度為100μg/ml，然后在超凈臺上鋪平板，90mm直徑的培養皿約需25ml培養基。
5.Tris-HCl飽和酚(pH8.0)。
6.溶液Ⅰ含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，臨用前加溶菌酶至2mg/ml。
7.溶液Ⅱ含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，臨用前用兩種溶液的貯存液配制。
8.溶液Ⅲ5mol/L醋酸鉀溶液60ml(稱取29.4g醋酸鉀定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和雙蒸水28.5ml混合而成。
9.10mg/mlRNaseA稱取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，于100℃加熱煮沸15min滅活DNase，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于－20℃。如為Sigma公司產品，一般則不需加熱煮沸。
10.TE緩沖液(pH8.0)含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高壓蒸汽滅菌，4℃貯存。
11.限制性內切酶EcoRⅠ及其緩沖液只需購買國內試劑公司的產品即可，每種RE均配有2種緩沖液，在配套的緩沖液中該RE均可獲得100%酶切活性。
12.50×TAE電泳緩沖液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸餾水至100ml。1×TAE為配制瓊脂糖凝膠及其電泳的應用緩沖液。
13.溴酚藍指示劑溶液(6×上樣緩沖液)稱取溴酚藍100mg，加雙蒸水5ml，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后定容至50ml，加入NaOH1滴，調至藍色。
14.溴化乙錠(EB，1mg/ml)戴手套謹慎稱取EB20mg于棕色試劑瓶中，加20ml雙蒸水，溶解后貯于4℃備用，配制瓊脂糖凝膠時每100ml凝膠加50μlEB。
15.DNA分子量標準根據需要購買，一般濃度為0.5μg/μl。
16.其他試劑氯仿、異丙醇、無水乙醇。
【操作步驟】
1.將下列試劑緩沖液2μl，T-GFP質粒或pcDNA3.1質粒(1μg)，KpnI和ApaI各5～10U加至0.5mlEP管中，加雙蒸水至20μl，加蓋，混勻后稍離心，37℃水浴反應1h。
2.瓊脂糖凝膠電泳在進行酶切時預先灌好.稱取1g瓊脂糖，加2ml50×TAE電泳Buffer和98ml蒸餾水，在電爐或微波爐上溶解，配制成1%瓊脂糖凝膠100ml，稍冷后，加5μl10mg/mlEB，混勻.安裝好電泳槽和樣品梳，灌膠。
3.上樣在電泳槽內盛放1×TAE，撕去制膠托架兩端的封膠，將制膠托架裝入電泳槽內，小心取出樣品梳.取PCR樣品10μl，加2μl6×載樣buffer在Parafilm膜上混勻，上樣。
4.電泳正確連接電極，在100V恒壓條件進行電泳，待藍色染料泳過2/3段凝膠，停止電泳。
5.取出凝膠，在紫外分析儀上觀察結果，分析判斷酶切產物的大小。
6.將730bp的GFPcDNA和5.4kb的線性pcDNA3.1切膠回收（參見實驗三步驟9）。
用連接酶將GFPcDNA片段與線性的pcDNA3.1載體連接。
在0.2ml或0.5ml反應管中加入下列成分
pcDNA3.150ng
GFPcDNA100ng
T4連接酶2-3weissunits
10×連接緩沖液1μl
補超純水至總體積為10μl，常溫下放置30分鐘以上；也可以16℃或4℃過夜。
7.重組子的轉化
在無菌條件下按每管取100μl新鮮感受態細菌置于無菌的1.5ml塑料離心管中，共2管，分別加入連接產物和消毒水(作陰性對照)各5μl，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min。42℃，熱休克90s，中途不要搖動離心管，每管加800μl無抗生素的LB培養基，于37℃空氣搖床中以150r/min速度振搖45min，使細菌復蘇。每管取200μl加至含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻，室溫放置20min，使液體吸收，然后37℃倒置培養12～16h至單菌落形成。
8.提取質粒,酶切鑒定的陽性重組子,命名為pcDNA3.1-GFP?