真菌性腸炎的診斷比較困難，臨床病例多數被漏診或誤診，有些直到尸檢時才被發現。一是由于臨床癥狀一般不嚴重，缺乏特征性表現，少數甚至無明顯腹瀉，如曲菌腸炎；二是由于實驗室檢查中具確診意義的項目不多，有些項目又難以推廣應用。因此，真菌性腸炎的診斷需要運用多種方法，結合臨床經驗作綜合分析。
1.臨床診斷組織胞漿菌和副球孢子菌腸炎具有地方流行性，患者多為流行區居民或曾去流行區旅行。條件致病性真菌在正常情況下不致病，只有當人體免疫功能低下時才引起發病，如念珠菌、曲菌。若臨床表現不能用細菌性或病毒性感染來解釋，抗生素治療反而使癥狀加劇，腹瀉遷延不愈，同時還存在與免疫功能低下有關的基礎疾病或其他誘因如廣譜抗生素和免疫抑制藥的應用等，應考慮真菌性腸炎的可能，及時作糞標本病原學檢查或腸鏡活檢。對腹瀉伴有鵝口瘡的患者更不可忽視，必要時應用抗真菌藥做診斷性治療。
2.病原學診斷包括真菌形態學檢查和真菌培養。若糞標本直接鏡檢發現大量菌絲和孢子，并排除污染因素可確診為真菌性腸炎。僅有少量孢子則可能為正常帶菌，意義不大。真菌培養需連續3次陽性并為同一菌種，結合臨床方可確診。對于雙相型真菌，需分別在25℃和37℃條件下培養并染色鏡檢。以鑒定真菌形態，或進一步做動物接種試驗以鑒定真菌的致病性。
3.病理學診斷通過臨床診斷和病原學診斷仍不能確診的患者，腸鏡活檢是最后手段。在病理切片中找到菌絲和孢子，是真菌感染的直接證據，且曲菌、毛霉菌等真菌感染的病理變化又頗具特征，有診斷意義。腸活檢結果還可經動物接種試驗出現類似病理改變，來加以證實。
4.免疫學診斷以檢測真菌循環抗原最具診斷意義，但往往因交叉反應而不能確定菌種。試驗陽性提示曾經感染，適用于流行病學調查，對急性感染的診斷價值不大。特異性檢測則常常由于患者伴有免疫功能低下而出現假陰性，應用范圍有限。