真菌纖維素酶及其在飼料中的應用

纖維素是地球上最豐富的多糖物質，它廣泛而大量地存在于谷物、豆類、麥類及其加工副產品等畜禽飼料里，是多個葡萄糖殘基以 β-1，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重復單位為纖維二糖。在天然纖維素中，木質素和半纖維素形成牢固結合層，緊密地包圍纖維素。除了反芻動物借助瘤胃微生物可以利用一部分纖維素外，豬、雞等單胃動物胃腸道內因缺乏纖維素酶而不能利用，大大限制了纖維素在飼料上的利用[1]。纖維素酶(cellulase)是指能水解纖維素β-1，4-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組起協同作用的復雜酶系，主要由細菌和真菌產生。細菌纖維素酶產量少、活性低、酶系單一（主要是Cx酶），而且不能分泌到胞外。絲狀真菌具有諸多優點：產生纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和提取；產酶效率高，產生纖維素酶的酶系結構較為合理，相互間能發生強烈的協同作用；可同時產生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。大部分真菌產酸性纖維素酶，有利于在畜禽胃腸道里發揮作用，所以目前飼用纖維素酶大多來源于真菌。 
真菌纖維素酶主要包括3種組分：外切葡聚糖酶(C1酶，exo-1，4-β-D-glucanase，G3.2.1.91，來自真菌的簡稱CBH)、內切葡聚糖酶(Cx酶，endo-1，4-D-glucnase，EC3.2.1.4，來自真菌的簡稱EG)和葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21，簡稱BG)，也稱纖維二糖酶[2]。真菌纖維素酶屬于異構酶，3種組分都有多種異構體。如CBH主要包括cbh1和cbh2兩種異構酶；EG主要有egl1、egl2、egl3和egl5，其中egl1為主要內切葡聚糖酶；BG有bgl1和bgl2兩種異構酶。這3種組分的分工不同，C1和Cx酶主要溶解纖維素，BG酶主要將纖維二糖、纖維三糖轉化為葡萄糖，當它們的活性比例適當時，就能協同作用將纖維素徹底水解成較小的寡糖或者低聚糖，從而有利于動物吸收[3]。
1 纖維素酶的真菌來源及菌種選育
1.1 真菌來源
纖維素酶的真菌來源非常廣泛，比較典型的有木霉屬（Trichoderma sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）和青霉屬（Penicillium），另外還有血紅栓菌、疣孢漆斑菌QM460、變色多空霉、乳齒耙菌、腐皮鐮孢、嗜熱毛殼菌QM9381和嗜熱子囊菌QM9383等，其它真菌也產纖維素酶。其中里氏木霉（T. reesei）和黑曲霉（A.niger）是公認的安全微生物，不產生毒素，而且產率高、酶系全、活性高、較為穩定，是目前應用最廣的纖維素酶生產菌。
1.2 菌種選育
優良菌株的選擇是纖維素酶發酵生產的前提和關鍵之一。可以利用物理、化學誘變劑單獨或復合處理微生物孢子或細胞的方法來選育纖維素高產菌種，如董志揚等（2000）用康寧木霉通過γ射線照射和亞硝基胍交替處理，誘變出一株纖維素酶高產菌株T801，與出發菌株相比，其產酶能力提高1.77倍[4]；邱雁臨等（2002）以綠色木霉NO為出發菌株，經紫外線、亞硝基胍誘變處理，得到耐高溫、高酶活菌株110，其中內切葡聚糖酶的酶活提高了2.8倍[5]；管斌等（2002）通過紫外線等對里氏木霉進行誘變處理，采用低劑量、反復多次復合誘變處理方法，用 “2－脫氧葡萄糖”作為降解產物阻遏物的高效篩選方法，選育得到一株抗分解代謝阻遏物的突變株，使纖維素酶活力提高3倍[6]。
真菌纖維素酶系中常常會由于某種組分酶活性較低而不能很好的發揮協同作用，針對這種缺陷，有學者提出了可利用原生質體融合技術來打破物種間細胞不能相互融合的障礙，獲取具有全纖維素酶高產菌株[7]。他們還嘗試對不同屬種間的纖維素酶系的親和相容性或多態性進行研究，通過細胞融合，獲得了既能分解纖維素，又能分解木質素的穩定梭菌雜種菌株。
2 真菌纖維素酶基因的克隆與表達
近年來，隨著現代生物技術的迅猛發展，越來越多的真菌纖維素酶基因得到克隆和表達。經過對比發現，不同真菌菌株的同一類型的纖維素酶基因有較高的同源性，但同一菌種不同類型的纖維素酶基因間的同源性相對較低[8]。已知里氏木霉有8個纖維素酶基因得到克隆，包括編碼纖維二糖水解酶的cbh1、cbh2和編碼內切葡聚糖酶的egl1、egl2、egl3、egl4和egl5[9]，以及編碼β-葡萄糖苷酶的bgl4。測序比對發現，cbh1與egl1同源性為52％；cbh2與egl3整體同源性很小，而且它們與cbh1和egl1兩個基因基本上不存在整體同源性；而里氏木霉cbh1與綠色木霉cbh1基因的同源性達95％，里氏木霉egl3與裂褶菌egl1基因的同源性也較高。由此可以看出，不同類型的纖維系酶基因的進化是各自獨立的，在進化之初可能只存在一個纖維素酶基因，它編碼糖酵解酶的前體，但由于進化選擇的壓力，這一基因發生了突變進化，通過這種歧異進化，形成了一個復雜的真菌纖維素酶基因家族[10]。這種進化是纖維素酶對天然纖維素復雜結構的適應。
通過構建基因工程菌來提高纖維素酶產量和質量已成為推動纖維素酶廣泛應用于飼料業生產中的重要手段。幾乎所有已克隆的纖維素酶基因都已在大腸桿菌中得到表達。但是這一原核表達系統的表達水平很低，產生的酶多數不能分泌到胞外，因而難以提取。為了得到胞外分泌產物，一些纖維素酶基因已在枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、乳酸發酵短桿菌和變青鏈霉素等中得到了有效表達。但由于纖維素酶基因在異源宿主中的表達要遇到蛋白酶水解和糖基化等問題，其分泌機制尚不清楚，無法達到纖維素酶生產要求。所以現在大多采用真核表達系統來表達纖維素酶基因。真菌纖維素酶基因在酵母中的表達是纖維素酶用于工業生產的一個重要途徑。這是因為，酵母可以克服在原核表達系統中無法進行特定翻譯后修飾的缺陷，不產生毒素，是一種較為理想的真核表達系統；用其表達纖維素酶基因，其產物高度糖基化，表達水平高，而且產物直接分泌至胞外。如Godbole等[11] （1999）將T. reesei cbh1在Pichia pastoris中成功地轉化并表達。肖志壯等[12](2001)利用PCR法從瑞氏木霉cDNA文庫中擴增出內切葡聚糖酶1(egl1)全長基因并克隆到釀酒酵母非整合型表達載體pAJ401上，表達出具有活性的egl1酶蛋白。近年來，以Aspergillus oryzae為表達系統的研究也漸漸增多。Takashima等[13](1999)將T. reesei bgl2 基因在A. oryzae中表達成功，酶活檢測顯示了EG酶活性。
但是，目前利用酵母表達外源纖維素酶基因的水平有限，故如何建立有效的纖維素酶基因真菌表達體系，提高酵母表達纖維素酶的產量有待進一步研究[14]。
3 真菌纖維素酶的生產
生產真菌纖維素酶有固體發酵[15]和液體發酵兩種方法。和固體發酵法相比，液體發酵有發酵動力消耗大、設備要求高等缺點，但具有原料利用率高、生產條件易控制、產量高、勞動強度小、產品質量穩定、不易污染、可大規模生產等優點，是發酵生產纖維素酶的必然趨勢[16]。
目前，真菌纖維素酶的生產多采用液體深層發酵法，在此基礎上又出現了流加培養法、分批發酵法、連續發酵法、二次發酵法及細胞循環法等。由于不同真菌的纖維素酶系在各組分均衡性方面有互補現象，纖維素酶各組分之間生化性質的復雜性和酶學作用的交迭及異構酶的存在，纖維素酶系均衡性的研究引起了人們的注意。因此，通過微生物混合發酵生產出優質高效的混合纖維素酶系顯得尤為重要[17]，如應用最廣泛的里氏木霉常常存在β－葡萄糖苷酶活力較低的不足，導致纖維二糖積累，降低酶解效率。為改善纖維素酶系各組分的相對含量，從而充分發揮它們之間的協同作用，曹健等[18]（2003）在優化里氏木霉培養條件提高酶活的同時，添加一定比例的黑曲霉進行混合培養，利用黑曲霉產生的β－葡萄糖苷酶明顯改善了里氏木霉纖維素酶系的協同作用效果，在最適培養條件下，粗酶液的β－葡萄糖苷酶活和濾紙酶（FPA）酶活分別達到127.6U/ml和84.8U/ml，β－葡萄糖苷酶的產量是對照組的2.9倍，FPA酶活提高了近2.3倍。涂璇等[19]（2004）研究了2種曲霉(UF2和UA8)二元混菌體系和兩種曲霉與1種酵母菌組成的三元混菌體系混合發酵對纖維素酶系3種酶組分活性的影響。結果表明：2種霉菌按一定比例接種進行混合發酵時3種纖維素酶組分的活性較單菌發酵大幅度提高，濾紙酶(FPA)、微晶纖維素酶(AVI)和羧甲基纖維素酶(CMC)活性分別較UA8單菌發酵提高2.2％～51.1％、20.7％～332.6％和29.4％～29.6％ ；向由兩種霉菌組成的二元混菌發酵體系中接入酵母菌可顯著降低3種纖維素酶組分的活性；3菌混合發酵能使纖維素酶3組分的產酶高峰出現時間較雙菌混合發酵滯后約24h，但3菌與雙菌混合發酵3種纖維素酶組分的酶活峰值無明顯差異；雙菌混合發酵有利于縮短纖維素酶生產發酵周期，為利用多菌混合發酵提高纖維素酶活性研究和技術開發提供參考。
4 在飼料上的應用 
真菌纖維素酶作為飼料添加劑在動物體內的主要營養作用有：降解植物細胞壁，釋放胞內養分；激活內源酶的分泌，補充內源酶的不足；消除抗營養因子，降低飼料粘性，提高酶的催化效率；改善胃中菌群結構及比例，同時增加單細胞蛋白含量；維持小腸絨毛形態完整、促進營養物質的吸收；能與半纖維素酶、果膠酶、β－葡聚糖酶等其它酶協同作用，因此，使用復合酶制劑要比單獨使用纖維素酶的效果好[20]。近年來國內外大量的飼養試驗、消化代謝試驗[21-25]都已證明，在畜禽飼料中添加纖維素酶能明顯提高動物對粗纖維、粗蛋白等營養物質的利用率，促進生長發育和改善生產性能。
另外，纖維素酶在草食性家畜胃腸疾病的治療方面也有一定應用。纖維素酶降解纖維素的功能一方面直接降低了它們的致病因素；另一方面，使可溶性物質含量增加，促進有益微生物的活動。焦平林等（1996）給32頭患白痢黃的犢牛每天服纖維素酶50g，并結合使用抗菌類藥物，32頭黃犢牛全部治愈，治愈率100％；對17頭患前胃遲緩的黃牛每天內服纖維素酶40g，治愈16頭，治愈率94.12％；對19頭患瘤胃積食的黃牛，使用纖維素酶進行治療，治愈16頭，治愈率84.21％，總治愈率92.78％，表現出了理想的治療效果[26]。陳俠甫等（1988）在多年研究的基礎上認為，纖維素酶對馬急慢性消化不良、便秘，牛前胃遲緩、瘤胃膨脹、瘤胃積食等疾病具有明顯療效[27]。
5 總結
我國是一個飼料資源十分緊張的國家，人畜爭糧的矛盾比較突出，要保持我國飼料工業和畜牧業的持續發展，必須解決好飼料資源緊張的問題。纖維素是自然界十分豐富的資源，如能加以充分利用，必將產生巨大的經濟效益。目前所選育的菌株雖然具有一定的產酶能力，但應用于生產還很不理想，仍然需要尋找新的產纖維素酶菌株或進一步選育高產菌株。高產真菌的基因克隆表達仍是一個重要的研究方向。此外，纖維素酶系的協同降解機制還需要進一步深入研究，以便更好地發揮各組分的作用，使纖維素充分水解。因此，今后應加強這些方面的研究以使其在實際生產中得到更廣泛的應用。
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