調節瞬時轉染基因的表達
*四環素作為哺乳動物細胞中可誘導基因表達的調控物
階段一：pTet-tTAk穩定轉染成纖維細胞
培養和轉染細胞
1. 在DMEM完全培養液中培養貼壁細胞。轉染前一天，把細胞換到含有0.5μg/ml四環素-HCl（四環素）的DMEM完全培養液中。每個10 cm培養皿中加入足量細胞，使轉染那天，細胞可以有33%的匯合度。
2. 在合適的限制性內切酶位點使質粒線性化，并把每秒質粒的濃度調整為≥0.5 mg/ml。10～20μg質粒pTet-tTAk和1～2μg
pSV2-His（Tet質粒與帶選擇標記的質粒的摩爾比大約為10：1）與500μl HEPES緩沖液在一個干凈的4 ml聚丙乙烯管中混合。
3. DNA混合物中加入32.5μl 2 mol/L CaCl2。立即輕輕振蕩使溶液混勻。溶液在室溫保存，不時地混勻。15～30 min后會形成絮狀沉淀。
4. 吸掉步驟1準備的細胞培養皿中的所有培養液。
5. 用巴斯德吸管混合CaCl2-DNA若干次。滴加混合物，使它均勻地蓋在單層細胞上。
6. 細胞在37℃，5% CO2條件下培養30 min，15 min后搖動培養皿，保證DNA沉淀物的均勻覆蓋。
7. 每個細胞培養皿中加入10 ml含有四環素的DMEM完全培養液。細胞在37℃，5% CO2條件下培養4～5 h。
8. 輕輕吸掉培養液。避免破壞細胞上的沉淀物。
9. 加2.5 ml含15% 甘油而且預熱到37℃的HEPSE緩沖液進行甘油休克。細胞在室溫放置2.5 min。甘油是滴加到培養液中。
10. 恰好在2.5 min的時候吸掉甘油溶液。操作得快一點，因為甘油對細胞毒性很大。
11. 立即又輕又快地加入10 ml含有四環素地DMEM完全培養液洗細胞。立即吸掉培養液，再重復洗滌。
12. 細胞中加入10 ml含有四環素地DMEM完全培養液，37℃培養過夜。
13. 轉染后大約16～24 h，吸掉培養液，換上10 ml含有四環素的DMEM完全培養液。轉染后一共在37℃培養48 h（即步驟12和13的總培養時間）。
轉染細胞的篩選和克隆
14. 轉染后48 h，細胞用幾種稀釋度分到含有125μmol/L L-組氨醇和0.5μg/ml四環素-HCl的培養液中。細胞密度為每個10 cm培養皿大約1×106到3×104。含有大約1×105細胞的培養皿需要培養若干個。
15. 細胞在選擇培養液中培養4天后，接著用3～4 ml含有125μmol/L L-組氨醇和0.5μg/ml四環素-HCl的選擇培養液培養。
16. 集落形成后（通常經過大約10～12天選擇培養），換成含有250μmol/L L-組氨醇和0.5μg/ml四環素-HCl的選擇培養液。
17. 集落長好以后（選擇培養12～15天），在培養皿的底部用圓畫出每個集落的邊界。吸掉培養液，在培養皿的單個克隆上放置無菌的塑料克隆環。每個挑選的集落重復這個步驟。從培養皿挑選細胞，要求單個集落隔得比較開，而且易于分辨。
18. 用大約100μl磷酸緩沖液很快地洗克隆。為了使細胞脫落，加2滴1×胰酶-EDTA（100μl）并放置30～60s。用巴斯德吸管上下吹打使細胞變松。每個集落轉移到24孔組織培養液板的一個孔中，每個孔中有1
ml含250μmol/L L-組氨醇和四環素的選擇培養液。
19. 當孔中的細胞長到80%匯合度，把它們轉移到6 cm組織培養皿中，用含有500μmol/L L-組氨醇和四環素的選擇培養液。
20. 細胞在含有500μmol/L L-組氨醇和四環素的選擇培養液中擴大培養（通常細胞進行1：5到1：10稀釋）。
細胞進行蛋白誘導表達測試
21. 當單層細胞再次生長到大約80%匯合度，每個細胞克隆收集一部分，在液氮中凍存。余下的細胞進行傳代培養，直到數量足夠用于測試蛋白的誘導表達。
22. 如果細胞用tTA和靶質粒共轉染，可以如階段3所述直接分析靶基因的產物。如果細胞只用pTet-tTAk質粒轉染，如下進行細胞的誘導表達測試：
a. 誘導前一天，細胞以適當的密度在含有500μmol/L L-組氨醇和0.5μg/ml四環素-HCl的DMEM培養液培養，使它們在收獲時可以達到亞匯合態。
b. 第二天，用PBS細胞洗細胞3次，每次都要輕輕旋轉培養板。
c. 第三次洗滌后，立即加入含有500μmol/L L-組氨醇但不含四環素的選擇培養液。細胞在含或不含四環素的培養液中培養6～48 h。
23. 通過Northern分析或免疫印跡法測試細胞中tTA的誘導表達。然后如階段2所述，用靶質粒轉表達tTA的細胞系。
階段2：四環素調控的靶基因穩定轉染可誘導表達tTA的NIH-3T3細胞
培養和轉染細胞
1. 在含有500μmol/L
L-組氨醇和0.5μg/ml四環素-HCl完全選擇培養液中培養可以誘導表達自身調控的tTA的穩定細胞系（階段1中的分離得到）。轉染前一天，把細胞傳代到含有完全選擇培養液的10
cm組織培養皿中。每個培養皿轉入足量細胞，使轉染那天單層細胞可以有33%的匯合度。
2. 在合適的限制性內切酶位點使質粒線性化，并把每種質粒的濃度調整為≥0.5mg/ml。每種靶基因質粒10～20μg和1～2μg
pPGKPuro（每種四環素質粒與帶選擇標記的質粒摩爾比位10：1）與500μl HEPES緩沖液在一個干凈的4 ml聚丙乙烯管中混合。
3. 進行階段1中步驟3-13。
選擇和克隆轉染細胞
4. 轉染后48 h，細胞用幾種稀釋度分到含有500μmol/L L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四環素的選擇培養液中。細胞密度為每個10 cm培養皿大約1×106到3×104。含有大約1×105細胞的培養皿需要培養若干個。
5. 細胞在選擇培養液中培養4天后，接著用3~4 ml含有500μmol/L L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四環素的選擇培養液培養。
6. 集落長好以后（選擇培養12～14天），在培養皿的底部用圓畫出每個集落的邊界。吸掉培養液，在培養皿的單個克隆上放置無菌的塑料克隆環。每個挑選的集落重復這個步驟。從培養皿中挑選細胞，要求單個集落隔得比較開，而且易于分辨。
7. 用大約100μl磷酸緩沖液很快地洗克隆。為了使細胞脫落，加2滴1×胰酶-EDTA（~100μl）并放置30～60
s。用巴斯德吸管上下吹打使細胞變松。每個集落轉移到24孔組織培養板的一個孔中，每個孔中有1 ml含有500μmol/L
L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四環素的選擇培養液。
8. 當孔中的細胞長到80%匯合度，把它們轉移到6 cm組織培養皿中，用含有500μmol/L L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四環素的選擇培養液培養。
9. 細胞在含有500μmol/L L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四環素的選擇培養液中擴大培養（通常細胞進行1：5到1：10稀釋）。
10.當單層細胞再次生長到大約80%匯合度，每個細胞克隆收集一部分，在液氮中凍存。余下的細胞進行傳代培養，直到數量足夠用于測試靶基因蛋白的誘導表達。測試方法在階段3介紹。
階段3：分析轉染細胞中的蛋白質表達
細胞的生長和誘導
1. 誘導前一天晚上，細胞以適當的密度在含有500μmol/L L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四環素-HCl的DMEM培養液中培養，使它們在收獲時可以達到亞匯合態。
2. 第二天，用PBS洗細胞3次，每次都要輕輕旋轉培養液。
3. 第三天洗滌后，立即加入含有500μmol/L L-組氨醇、3μg/ml嘌呤霉素但不含四環素的選擇培養液。細胞在含或不含四環素的培養液中培養6～48 h。
收獲細胞
4. 細胞生長適當的時間后，快速收獲并放到冰浴的管中。
5. 每個克隆和對照都轉移0.5×106細胞到離心管中，然后所有管子在4℃以3000 r/min（低或中速）離心5 min。
6. 加1 ml冰冷的磷酸鹽緩沖液洗細胞。如步驟5洗細胞，輕輕吸掉上清，不要擾動細胞沉淀。
7. 細胞沉淀放在冰浴上，在離心管架上放的孔中輕快地旋動管子使沉淀變松，然后把它凍存在-70℃。
準備裂解物
8. 細胞沉淀用30μl蛋白樣品緩沖液重懸，輕輕地吹打細胞，然后振蕩管子。
9. 細胞在蛋白樣品緩沖液中煮10 min。
10. 以最大速度離心2 min收集細胞碎片。
11. 在Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠的每個冰道加10μl細胞裂解物。
12. 用合適的時間跑膠。
13. 蛋白從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電轉移到PVDF膜上，用合適的抗體檢測。
