一、自噬簡介
1、大自噬（macroautophagy），也就是通常說的自噬（autophagy），是真核細胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細胞質內的成分（細胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進而傳遞到溶酶體進行降解的過程。
詳細來說，自噬過程與內涵體途徑（endolysosomal pathway）密不可分（見圖1）。一方面，自噬體能夠與晚期內體（late endosome）融合形成中間囊泡（amphisome）最終形成自噬溶酶體（autolysosome）；另一方面，自噬體能夠直接與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體。無論通過哪條途徑，自噬溶酶體最終通過酸性水解酶將細胞器、蛋白等消化分解。
細胞本底水平的自噬發生在營養充足的條件下，可保護細胞免受錯誤折疊蛋白或受損細胞器的影響，從而防止某些疾病的發生（如神經退行性疾病和癌癥）。饑餓等也可誘導自噬的發生，通過降解大分子物質和細胞器為細胞活動提供營養和能量。
圖1 自噬過程及其與內涵體途徑的關系
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)
2、自噬的調控
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在自噬反應中起著重要的調節作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，自噬反應被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）未被抑制后，自噬反應機制被啟動。作為酵母中Atg1的同系物，三個相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶 UNC-51樣酶-1，-2，-3（ULK1, ULK2, UKL3），通過與mTOR復合物之間的相互作用來實現自噬反應。ULK1、ULK2、mAtg13和骨架蛋白FIP200（酵母Atg17的同系物）一起形成一個復雜的復合物。Class III PI3K復合物由hVps34, Beclin-1 (酵母 Atg6的同系物), p150 (酵母Vps15同系物), 和類Atg14蛋白 (Atg14L or Barkor) 或者紫外線放射抗性相關蛋白UVRAG (ultraviolet irradiation resistance-associated gene )蛋白組成，其在誘導自噬反應中起關鍵作用。Atg基因通過形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)復合物來調控自噬體的形成。在Atg7和Atg710（分別對應泛素活化酶E1和泛素結合酶E2酶）的作用下，Atg12和Atg5之間通過一個類泛素反應結合形成Atg12-Atg5，Atg12-Atg5再通過非共價鍵與Atg16結合形成多聚體Atg12-Atg5-Atg16，參與自噬體的擴張。在Atg4、 Atg7和Atg3的作用下，LC3轉變為LC3-II-PE并緊密結合于自噬泡膜表面，參與前自噬體的延伸。
自噬既能抑制也能促進細胞凋亡，兩種反應在生物體內廣泛存在。在營養缺乏時，自噬反應作為一個細胞的促活反應機制存在，但是過量的自噬反應也會導致細胞死亡，但由自噬導致的細胞死亡與細胞凋亡在形態學上有明顯的不同。幾種促凋亡信號因子，如TNF, TRAIL, and FADD也會誘導自噬的反應發生。此外，Bcl-2也是自噬反應重要的調節因子，其為凋亡抑制蛋白，通過與Beclin-1結合形成復合物，來抑制由Beclin-1誘導的細胞自噬。
線粒體自噬屬于選擇性自噬，其主要作用是降解細胞中損傷以及不需要的線粒體。當線粒體損傷之后，在正常的線粒體中持續被降解的PINK蛋白（PARL促進此反應）會處于穩定狀態，再通過E3連接酶Parkin的作用來誘導線粒體自噬。Parkin會誘導線粒體膜蛋白的聚泛素化，由此導致與LC3結合的自噬受體蛋白的SQSTM1/p62, NBR1, and Ambra1聚集。此外，在特定的細胞類型中，同樣存在LC3結合區域（LIR）的BNIP3 和 BNIP3L/NIX直接通過泛素依賴型反應機制也會聚集自噬反應的相關因子，進而促進自噬體的形成。
3、LC3
LC3（light chain 3）簡稱于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公認的自噬標記物。哺乳動物中的LC3與酵母中的自噬相關蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。
LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸殘基，產生細胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）共價結合，形成LC3-II并定位于自噬體膜上（見圖3）。哺乳動物中的LC3可分為三種： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作為LC3的一種，同樣可以用作自噬的分子標志。
圖3 LC3在自噬體形成中的作用
(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)
4、自噬流檢測方法
細胞經自噬誘導或抑制后，需對自噬流的水平進行觀察和檢測，常用的技術手段見表1：
表1 自噬體計數及自噬流檢測方法匯總
（Mizushima et al, Cell, 2010）
其中，電鏡觀察法由于受到實驗條件和設備的限制應用范圍有限；而由于自噬過程發生快速，通過IB/WB檢測LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到實驗進行時長的影響。
想要準確檢測自噬流的變化，需要多種技術手段共同使用，才能達到理想的實驗效果，產生具有說服性的實驗結果。
自噬雙標產品 ：mCherry-GFP-LC3B腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相關病毒（AAV）
mCherry-GFP-LC3B自噬雙標系統的工作原理為： 未發生自噬的細胞及含有自噬體的細胞中，由于mCherry與GFP共同表達，細胞呈現黃色熒光。當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進而使自噬溶酶體呈現紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻（見圖4和附圖）。
Vigene現推出mCherry-GFP-LC3B腺病毒、慢病毒和腺相關病毒，滿足您實驗的不同需要。
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