石蠟切片免疫組化實驗

石蠟切

PBS 檸檬酸鹽緩沖液 蒸餾水 增強劑 酶標抗鼠 兔聚合物 蘇木素 酒精 二甲苯 樹膠 鹽酸 二氨基聯苯胺

烘箱 微波盒 塑料切片架 顯微鏡 膠頭滴管

1.  石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。

2.  取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復的，視具體情況而定）

3.  每張切片加1滴3%H₂O₂，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。

4.  除去PBS液，每張切片加1滴相應的第一抗體（相應稀釋倍數），室溫下孵育2小時。

5.  PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。

6.  除去PBS液，每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。

7.  除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯苯胺），顯微鏡下觀察5分鐘。

8.  蘇木素復染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.  在切片加上一抗后，第二抗體標記多聚螯合物酶（HRP）的復合物與一抗結合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號有顯著的放大，其敏感性較SABC、SP法高。

2.  由于多聚物在體內不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3.  辣根過氧化物酶與二抗結合在多聚物上，替代傳統方法的 二抗、三抗，減少了實驗步驟，且試劑孵育時間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡單，實驗時間比SABC、SP法大為縮短。

一、特點

1.  在切片加上一抗后，第二抗體標記多聚螯合物酶（HRP）的復合物與一抗結合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號有顯著的放大，其敏感性較SABC、SP法高。

2.  由于多聚物在體內不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3.  辣根過氧化物酶與二抗結合在多聚物上，替代傳統方法的 二抗、三抗，減少了實驗步驟，且試劑孵育時間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡單，實驗時間比SABC、SP法大為縮短。