硝酸纖維素濾膜結合實驗確定RNA蛋白質解離常數實驗

核酸酶

緩沖液

硝酸纖維素濾膜滅菌瓶聚丙烯微量滴定板點雜交裝置移液器微孔玻璃過濾裝置

一、材料與設備

所有緩沖液必須用去除離子、有機物和生物污染的去離子水配制，但是核酸酶污染還是一個常見的問題，每個溶液必須采用硝酸纖維素濾膜過濾除去核酸酶，溶液儲存在滅菌瓶中。使用移液管或塑料吸頭轉移液體，使用高純度的試劑以避免核酸解的污染，否則可能造成解離常數的改變。

1. 點雜交所用裝置如下：

(1) 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell （Keene 公司，NH，USA）0.2 μm 硝酸纖維素濾膜 ( BAS ) 或者 4 英寸 X 5 英寸的  DEAE 膜和 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell 0.15 μm 的硝酸纖維素濾膜（BA45）。

(2) 96 孔聚丙烯微量滴定板。

(3) 點雜交裝置。

(4) 八道移液器。

2. 單個濾膜裝置：

(1) 硝酸纖維素濾膜：Schleicher 和 Schuell BA85 0.45 μm 或 0.2 μm 的濾膜。

(2) 25 mm 微孔玻璃過濾裝置。

將硝酸纖維素濾膜置于塑料袋中儲存在 4℃ 防止干燥，陳舊的濾膜容易發生不均勻的濕潤，干燥時易碎而變得不可靠。必須記住當過度加熱或者敲擊時硝酸纖維可以發生破裂，陳舊的則更加易碎。

聚丙烯微量滴定板使用前在 1 mol/L HCl 中浸泡 30 min，以去除痕量的 RNase 或黏附的蛋白，這樣處理后可以多次使用。聚羧酸酯或聚苯乙烯板沒有杭酸性能，更容易在表面黏附蛋白。

二、操作方法

1. 在合適的緩沖液和溫度下預先濕潤硝酸纖維素濾膜，此過程至少要 30 min，保證所有的面都接觸到緩沖液，沒有被緩沖液充分飽和的濾膜必須丟棄，避免手指接觸到濾膜。

2. 在微量滴定板上加入一定體積的樣品，用不斷增加的蛋白滴定定量的 ³²P 標記 RNA，用僅含 RNA 的孔作為對照，測量濾膜非特異性的 RNA 結合能力，一個常規的曲線應該涵蓋 3 到 4 個蛋白濃度的數量級，每組最少 5 個點（推薦更多的點來更準確的確定 中間點），高于（飽和）或低于（未飽和）基線的點都要適當。每個試驗平行進行兩次并取平均值。

3. 在潤濕后去除過量的緩沖液，用 Kimwipe 輕微封閉制備濾膜，以防止樣品在膜上的擴散。

4. 在過濾前，將膜插入到裝置中，打開真空泵即將樣品從板轉移到濾器，從最低濃度的蛋白樣品開始滴加，逐漸到高濃度，同一個滴頭可以在一個滴定過程中使用，過長時間的吸濾將導致過多滯留，因此此步必須迅速，所以在一個滴定時使用同一吸頭。在濾膜 和溶液之間可能產生氣泡而阻止過濾，這些氣泡必須清除，輕拍裝置的邊緣即可以達到目的。過分濃縮的蛋白在抽吸時也可能產生泡沬，這是蛋白變性的標志，所得結果也就不準確。

5. 移去濾膜小心吸干底下過量的緩沖液，以防止在表面擴散，導致單個的點變得模糊。

6. 采用感光成像儀測定結合在濾膜上的 RNA，可以在濾膜干燥或潮濕時進行，如果膜是濕潤的，將其包裹在 Saran 膜中再進行測定。直接測定結合的放射標記的 RNA 量， 結合量 (B) 和總量（T）直接進行比較，在沒有蛋白的情況下結合到膜上的 RNA 作為背景 ( O )，從每個數據點去除，得到（B-O）/T=F_B（片段結合），F_B 對蛋白質濃度的對數作圖即得到結合等溫線。

7. 分析結合檢測結果，復合物的形成假設為兩個分子的結合，結合的化學式是 1:1，在 Langmuir 等溫線中查到數據對應的值即得到解離常數，下面是 Lin 和 Riggs 給出的公式：




常數 C 適合于基線以上（即當滯留率不足），可以用來標準化變化的滯留率。僅當一個單個數據列被標準化以后，才可以用復制的數據列進行分析，因此從最初的過濾獲得 C 值，每個 F_B 除以參數 C 得到 F_Bnom，它作為蛋白濃度的一個函數，用 F_Bnom 代替 F_B，去掉 C（或設為 1）再做一次。為了分析單個的數據列，一個 Macintosh 系統下的繪圖軟件例如 KaleidaGraph^TM 或 PC 就足夠了（Synergy Software），其他的一些軟件包可以處理更加復雜的分析，包括 Scientist^TM（MicroMath Sciennfic Software 公司）。