硝酸纖維素濾膜結合實驗確定RNA蛋白質解離常數實驗

核酸酶

緩沖液

硝酸纖維素濾膜 滅菌瓶 聚丙烯微量滴定板 點雜交裝置 移液器 微孔玻璃過濾裝置

一、材料與設備

所有緩沖液必須用去除離子、有機物和生物污染的去離子水配制，但是核酸酶污染還是一個常見的問題，每個溶液必須采用硝酸纖維素濾膜過濾除去核酸酶，溶液儲存在滅菌瓶中。使用移液管或塑料吸頭轉移液體，使用高純度的試劑以避免核酸解的污染，否則可能造成解離常數的改變。

1. 點雜交所用裝置如下：

(1) 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell （Keene 公司，NH，USA）0.2 μm 硝酸纖維素濾膜 ( BAS ) 或者 4 英寸 X 5 英寸的  DEAE 膜和 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell 0.15 μm 的硝酸纖維素濾膜（BA45）。

(2) 96 孔聚丙烯微量滴定板。

(3) 點雜交裝置。

(4) 八道移液器。

2. 單個濾膜裝置：

(1) 硝酸纖維素濾膜：Schleicher 和 Schuell BA85 0.45 μm 或 0.2 μm 的濾膜。

(2) 25 mm 微孔玻璃過濾裝置。

將硝酸纖維素濾膜置于塑料袋中儲存在 4℃ 防止干燥，陳舊的濾膜容易發生不均勻的濕潤，干燥時易碎而變得不可靠。必須記住當過度加熱或者敲擊時硝酸纖維可以發生破裂，陳舊的則更加易碎。

聚丙烯微量滴定板使用前在 1 mol/L HCl 中浸泡 30 min，以去除痕量的 RNase 或黏附的蛋白，這樣處理后可以多次使用。聚羧酸酯或聚苯乙烯板沒有杭酸性能，更容易在表面黏附蛋白。

二、操作方法

1. 在合適的緩沖液和溫度下預先濕潤硝酸纖維素濾膜，此過程至少要 30 min，保證所有的面都接觸到緩沖液，沒有被緩沖液充分飽和的濾膜必須丟棄，避免手指接觸到濾膜。

2. 在微量滴定板上加入一定體積的樣品，用不斷增加的蛋白滴定定量的 ³²P 標記 RNA，用僅含 RNA 的孔作為對照，測量濾膜非特異性的 RNA 結合能力，一個常規的曲線應該涵蓋 3 到 4 個蛋白濃度的數量級，每組最少 5 個點（推薦更多的點來更準確的確定 中間點），高于（飽和）或低于（未飽和）基線的點都要適當。每個試驗平行進行兩次并取平均值。

3. 在潤濕后去除過量的緩沖液，用 Kimwipe 輕微封閉制備濾膜，以防止樣品在膜上的擴散。

4. 在過濾前，將膜插入到裝置中，打開真空泵即將樣品從板轉移到濾器，從最低濃度的蛋白樣品開始滴加，逐漸到高濃度，同一個滴頭可以在一個滴定過程中使用，過長時間的吸濾將導致過多滯留，因此此步必須迅速，所以在一個滴定時使用同一吸頭。在濾膜 和溶液之間可能產生氣泡而阻止過濾，這些氣泡必須清除，輕拍裝置的邊緣即可以達到目的。過分濃縮的蛋白在抽吸時也可能產生泡沬，這是蛋白變性的標志，所得結果也就不準確。

5. 移去濾膜小心吸干底下過量的緩沖液，以防止在表面擴散，導致單個的點變得模糊。

6. 采用感光成像儀測定結合在濾膜上的 RNA，可以在濾膜干燥或潮濕時進行，如果膜是濕潤的，將其包裹在 Saran 膜中再進行測定。直接測定結合的放射標記的 RNA 量， 結合量 (B) 和總量（T）直接進行比較，在沒有蛋白的情況下結合到膜上的 RNA 作為背景 ( O )，從每個數據點去除，得到（B-O）/T=F_B（片段結合），F_B 對蛋白質濃度的對數作圖即得到結合等溫線。

7. 分析結合檢測結果，復合物的形成假設為兩個分子的結合，結合的化學式是 1:1，在 Langmuir 等溫線中查到數據對應的值即得到解離常數，下面是 Lin 和 Riggs 給出的公式：




常數 C 適合于基線以上（即當滯留率不足），可以用來標準化變化的滯留率。僅當一個單個數據列被標準化以后，才可以用復制的數據列進行分析，因此從最初的過濾獲得 C 值，每個 F_B 除以參數 C 得到 F_Bnom，它作為蛋白濃度的一個函數，用 F_Bnom 代替 F_B，去掉 C（或設為 1）再做一次。為了分析單個的數據列，一個 Macintosh 系統下的繪圖軟件例如 KaleidaGraph^TM 或 PC 就足夠了（Synergy Software），其他的一些軟件包可以處理更加復雜的分析，包括 Scientist^TM（MicroMath Sciennfic Software 公司）。