現在質粒提取無論手提還是試劑盒,其根本原理大多還是堿裂解法:當菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時,蛋白質與DNA發生變性,當加入中和液后,質粒DNA分子能夠迅速復性,呈溶解狀態,離心時留在上清中;蛋白質與染色體DNA不變性 而呈絮狀,離心時可沉淀下來。
進一步的質粒DNA獲取,手提是經過苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀 等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA以及過多的鹽分,而試劑盒則在此基礎上使用DNA吸附柱來吸附質粒DNA,在洗脫得到質粒。
評價:1,可通過瓊脂糖電泳來檢查所獲質粒的大小(準確大小需酶切),有無細菌基因組DNA和RNA污染,以及質粒的斷裂多少,同時也可根據marke量對樣品進行大致的濃度定量;
2,通過紫外分光光度計測定樣品OD280和OD260,計算其比值來衡量樣品的純度。經驗值:純DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1。6,表明有蛋白質、酚等污染)。同時,用紫外分光光度計對其進行精確濃度定量。
去除蛋白質:如上所言,提取質粒過程中,一部分蛋白質會在堿裂解法中形成沉淀,得以去除;還有更多不能形成沉淀的蛋白質在用酚/氯仿/異戊醇進行抽提的過程中被去除。