堿裂解或堿提取是分子生物學中用于從細菌中分離質粒DNA的方法。
方法
首先,含有感興趣質粒的細菌被培養,隨后通過離心濃縮細胞物質(包括DNA)至容器底部形成一個沉淀物。上清液被棄去,然后將沉淀物重新懸浮在含有EDTA的生理緩沖液中。EDTA的作用是與二價金屬陽離子如鎂離子和鈣離子結合,這些離子對于DNA降解酶(DNases)的功能至關重要,同時也有助于穩定DNA磷酸基團骨架和細胞壁。緩沖液中的葡萄糖將維持細胞的滲透壓,以防止細胞破裂。在緩沖液中加入三羥基尿素將保持細胞的pH值為8.0,而RNA酶將去除RNA,這將破壞實驗。
此外,還準備了一種強堿性溶液,該溶液由洗滌劑十二烷基硫酸鈉(SDS)和一種強堿如氫氧化鈉(NaOH)組成,并隨后加入。所得混合物經過幾分鐘的培養。在此期間,洗滌劑破壞細胞膜,使堿性物質能夠接觸并去折疊染色體和質粒DNA。在SDS撕裂細胞膜后,細胞內容物將中和氫氧化鈉;這就是為什么溶解pH值從12.8降至12.3的原因。因此,若細菌細胞數量不足,多余的氫氧化鈉將用于生成小的DNA片段。然而,0.5M L-精氨酸能夠提供穩定的pH值,可用于替代0.1M的氫氧化鈉。
最后,加入醋酸鉀。此酸化溶液,使得質粒DNA得以再溶,但不包括染色體DNA,后者會從溶液中沉淀出來。鉀的另一個功能是促使硫酸鈉十二烷基磺酸鹽的沉淀,從而去除洗滌劑。最終離心處理完成,這一次形成的沉淀物僅含有雜質,可被丟棄。含有質粒的上清液被小心地移除,可以進一步純化或用于分析,如凝膠電泳。
其他用途
此外,有時還會使用堿性裂解法來提取植物遺傳物質。植物細胞被置于一種強堿性溶液中,該溶液含有洗滌劑(通常為兩性或非離子型洗滌劑,如Tween 20),然后在高溫下進行培養。由于氫氧化鈉對遺傳物質的潛在損害性,使得該方法不常被采用,從而降低了DNA片段的大小。
堿裂解法提取質粒dna的原理是:高PH的溶液會使細胞壁粕類從而使得DNA和蛋白質變性。
將細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中,會使細胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質變性,將質粒DNA釋放到上清中。
盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞,閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離,這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要用堿處理的強度和時間不要太過,當pH值恢復到中性時,DNA雙鏈就會再次形成。
在裂解過程中,細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時,復合物會從溶液中有效地沉淀下來,離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
在SDS存在的條件下,堿水解是一項非常靈活的技術,它對E. coli的所有菌株都適用,并且其細菌培養物的體積可以從1-500mL以上。
堿裂解法適用于小量質粒DNA的提取,提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下:
1、接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2mlLB培養基。
2、37℃振蕩培養過夜。
3、取1.5ml菌體于Ep管(離心管),以4000rpm離心3min,棄上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH,1%SDS),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5min。