在C4植物葉肉細胞的葉綠體中，在有關酶的催化作用下，一個CO2被一個叫做磷酸烯醇式丙酮酸的C3(英文縮寫符號是PEP)固定，形成一個C4。C4進入維管束鞘細胞的葉綠體中，釋放出一個CO2，并且形成一個含有三個碳原子的有機酸——丙酮。
這種能夠固定CO2的酶，叫做磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，簡稱PEP羧化酶。
釋放出來的CO2先被一個C5固定，然后很快形成兩個C3。在有關酶的催化作用下，一些C3接受ATP和NADPH釋放出的能量并且被NADPH還原，然后經過一系列復雜的變化，形成糖類等有機物；另一些C3則經過復雜的變化，又形成C5，從而使暗反應階段的化學反應不斷地進行下去。C4釋放出的CO2的變化情況，與C3植物暗反應階段的變化情況相同。丙酮酸則再次進入到葉肉細胞中的葉綠體內，在有關酶的催化作用下，通過ATP提供的能量，轉化成PEP，PEP則可以繼續固定CO2。
由此可見，C4植物的光合作用中既有C4途徑，又有C3途徑，前者發生在葉肉細胞的葉綠體內，后者發生在維管束鞘細胞的葉綠體內，兩者共同完成二氧化碳的固定。
同C3途徑中有關的酶與CO2的親和力相比，C4途中PEP羧化酶與CO2的親和力約高60倍。
C4植物利用PEP將CO2固定在C4中，C4經過一系列的變化后，又把CO2釋放出來，這有什么意義呢？原來，C4途徑中能夠固定CO2的那種酶，對CO2具有很強的親合力，可以促使PEP把大氣中濃度很低的CO2固定下來，并且使C4集中到維管束鞘細胞內的葉綠體中，供維管束鞘細胞內葉綠體中的C3途徑利用。科學家們把C4植物的這種獨特作用，形象地比喻成“二氧化碳泵”(如圖1)。同C3植物相比，C4植物大大提高了固定CO2的能力。在干旱的條件下，綠色植物的氣孔關閉。這時，C4植物能夠利用葉片內細胞間隙中含量很低的CO2進行光合作用，而C3植物則不能。這就是C4植物比C3植物具有較強光合作用的原因之一。