磷酸交聯AFFIGEL10親和介質實驗——磷酸酪氨酸交聯

磷酸酪氨酸在肽交聯時所用的無水條件下是不溶的，因此交聯必須在水相條件下進行。按此節的步驟最終能產生 10 ml 柱床體積的親和樹脂；與肽類似，每毫升 Affi-Gel 10上能交聯 3 μmol 磷酸酪氨酸。

磷酸酪氨酸Affi-Gel 10

NaOH （可選）碳酸氫鈉乙醇胺·HCl乙醇胺

多孔玻璃漏斗真空吸液器玻璃層析柱帶螺口離心管離心機

1. 用 0.5～4 倍柱床體積的 0.4 % 碳酸氫鈉溶解磷酸酪氨酸。

2. 用 pH 試紙檢查 pH 是否在 7～8 的范圍內。如果需要調節 pH，用滴定的方法來進行中和，即加入少量的 1 mol/L NaOH，吸取 2～3 滴到 pH 試紙上測量，重復上述操作直到 pH 為7～8。

3. 將裝有 Affi-Gel 10 介質的瓶子搖蕩混合以使樹脂充分懸浮，取需要量的樹脂轉移到連有真空吸液器的多孔玻璃漏斗里。洗 3 次，每次將冷的蒸餾水倒在漏斗里的樹脂上，然后真空吸去液體。最后以相同的方法用冰冷的 0.4% 碳酸氫鈉洗 1 次。

4. 通過真空吸液去除樹脂上多余的液體，但不要使樹脂完全變干。將樹脂移入帶螺口蓋的離心管，加入步驟 2 中配制的磷酸酪氨酸溶液。

5. 4℃ 旋轉混合孵育過夜。

6. 每毫升樹脂加入 2 μl 乙醇胺，室溫下旋轉混合孵育 2 h。

7. 洗滌樹脂 2 次，每次低速離心（見「肽鏈交聯」步驟 3），吸去上清，重懸于 5 倍體積的 0.4% 碳酸氫鈉，再次低速離心。

8. 按步驟 7 的方法用 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl，pH 8.0 洗 2 次。第二次洗滌后，吸去洗滌液，換上新鮮的 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl 并于 4℃ 旋轉混合孵育過夜。然后低速離心，吸去上清。

9. 洗滌，儲存，填裝柱子（見「肽鏈交聯」步驟 8～12）。

確保至少吸取所需體積兩倍量的 Affi-Gel 10，因為體積會縮減。所買的樹脂一般是 50% 的懸浮液，因此必需取所需柱床體積的四倍的量。樹脂從瓶中取出到樹脂與磷酸酪氨酸溶液混合之間的時間不要超過 20 min。