神經干細胞的培養

新生SD大鼠

多聚甲醛 蒸餾水 PBS DAB 血清培養基 多聚賴氨酸 胎牛血清 雙蒸水

解剖顯微鏡 眼科剪 吸管 24孔培養板 制冰機 勻漿器

1.獲得特定腦組織。

2.獲取單細胞懸液通常有兩種方法。機械分離法操作步驟：

①用少量DF12液體覆蓋組織，再用虹膜剪剪碎組織塊成 1 mm³大小；

②將組織塊收集入神經干細胞培養液中；

③用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細胞懸液；

④細胞懸液過200目篩網；

⑤離心800r/min,3min,棄上清。

胰酶消化＋胰酶抑制劑終止法操作步驟：

② 用虹膜剪剪碎組織塊成1mm³大小；

②用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化組織，37℃-2min;

③加入胰酶抑制劑終止消化（使用濃度因生產公司不同、抑制劑活性不同而不同，可參考具體說明書）；

④800r/min離心3min,棄上清。

3.用神經干細胞培養液重懸，用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細胞懸液，細胞計數，接種，密度為1x10⁵/ml。

4.培養3-4d可以1/2量換液，培養7-10d進行傳代。程序：切收集神經球入離心管，800r/min離心3min;

(2)棄上清，加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化組織，37℃孵育3-Smin;

＠加入等體積的1X胰酶抑制劑終止消化；

＠收集細胞入離心管中，800r/min離心3min,棄上清；

＠加入新的神經干細胞培養液重懸，用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細胞懸液，細胞計數，接種。

5.培養的神經球可以接種于多聚賴氨酸包被的皿底或玻片上，加入神經干細胞分化液分化誘導，使其向子代細胞分化。由于神經千細胞懸浮培養的方法實際上是回顧性的判斷細胞的身份，即只有能夠持續傳代增殖并向多種方向分化的細胞才是真正的神經于細胞，因此，結果的判讀就要結合多種方法綜合判斷。進行實驗的時候也需要通過對照的設置來保證實驗的可信度。具體方法如下：

1.形狀：

如圖1-8,神經干細胞克隆增殖所獲得的球體一般形狀圓滑，質地緊密，細胞聚集體一般松散而不規則。

2．免疫.細胞化學染色：

如圖I-9,Nestin是神經干細胞的標志物，可以通過Nestin免疫熒光染色來進行鑒定。:

3.自我更新能力：

嚴格的神經于細胞實驗可以通過3-5次傳代來獲得純度較高的NSC。

4.分化潛能：神經球分化后可以用神經元標記物、星形膠質細胞標記物(GFAP)、少突膠質細胞標記物(PDGFR)等來進行子代細胞的免疫熒光染色，判斷所得到的細胞是否具有多向分化潛能。

1.要注意區分細胞聚集體和克隆球體，可以根據上述結果判讀方法進行。

2細胞增殖能力與組織來源動物的年齡以及所取腦區都有很重要的關系。胎齡越小干細胞所處發育狀態越幼稚，細胞的增殖能力越強；皮層來源的神經干細胞相比其他腦區更容易獲得增殖能力較好的細胞。

3.腦膜組織對于神經干細胞有誘導貼壁和分化的作用，所以，組織處理過程中一定要清除干凈腦膜組織等。

4血清對千神經干細胞有誘導分化的作用，所以終止消化時不能使用加有血清的培養液。

5傳代的時間一般為7-10d左右，但是如果神經球的體積較大，光鏡下觀察其中心已經開始出現黑色區域（產生黑色區域的原因可能是因為球體體積過大，影響光線透過，但是此時球體中心也往往會出現死細胞），則要及時傳代。

1.機械法分離獲得的細胞容易有細胞聚集，培養得來的球體就有可能不是單細胞克隆體；而消化法的消化液濃度和時間則要根據組織來源動物的不同年齡以及組織來源的不同區域進行調整，摸索最佳消化濃度和時間。

2.由于神經干細胞貼壁后也具有一定的促使分化的作用，所以，培養神經干細胞的皿或瓶最好用新的無劃痕的器皿。

3如果觀察到培養過程中出現貼壁細胞，可以通過更換培養瓶的方法來進行挽救，并且發現后越早更換越好。但是如果球體還沒有形成，則盡量不要更換器皿和觸碰細胞，否則會影響神經球的形成。

 參考《神經生物學實用實驗技術》第四軍醫大學出版社