神經系統免疫性疾病模型制作實驗1

神經系統自身免疫性疾病是以自體免疫細胞、免疫分子等攻擊神經系統為主要病理機制的自身免疫性疾病，可發生在中樞神經系統、周圍神經系統及神經－肌肉接頭處，導致神經元或軸索損傷、髓鞘脫失、神經－肌肉接頭破壞等病理改變。在中樞神經系統以多發性硬化(MS)、視神經脊髓炎(NMO)為代表。在周圍神經系統以急性炎性脫髓鞘性多發性神經病(AIDP),如格林－巴利綜合征(CBS)為代表。神經－肌肉接頭病變以重癥肌無力(MG)為代表。

相應的動物模型已經建立。如MS的動物模型為實驗性變態反應性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE),MG的動物模型為實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)和CBS的動物模型為實驗性自身免疫性神經炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)。根據模型誘導方案的不同，神經系統免疫性疾病動物模型可以分為主動免疫、被動轉移和病毒感染三類。其中主動免疫模型被應用的最為廣泛，也最能反映疾病的發生發展過程。被動轉移模型是采取已發生疾病的動物外周血或淋巴結淋巴細胞被動注射給同品系健康動物，而導致其發病。雖然被動轉移產生的動物模型在病理上和相應疾病類似，但是由于其產生過程、發展進程和疾病不同，因此主要用在探索EAE和MS的機制上。

實驗動物Lewis大鼠6-8周齡體重200-250g

免疫原MOG35-55片段其氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

(1)免疫原的制備MOG35-55片段，其氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,由公司合成(2)免疫方案包括：①第一次免疫(Od)異氟醚吸入麻醉下，MOG35-55:FCA(1:1)混合液4ml,百日咳桿菌菌液：PBS(1:50)混合液0.2ml于足墊處皮下注射；②第二次免疫(7d) 異氟醚吸入麻醉下，MOG35-55:FCA(1:1)混合液4ml,百日咳桿菌菌液:PBS(1:50)混合液0.2ml于肋下皮下兩側皮下注射。

結果判讀：成功模型的動物可出現體重下降、食量減少、肢體癱瘓、大小便失禁甚至死亡。形態學檢查可見到中樞神經系統內不同程度的炎性細胞浸潤和脫髓鞘，部分動物可同時合并軸突變性。存活者常在注射抗原后3周左右癥狀自行緩解，1月左右基本恢復。隨癥狀緩解，體重也逐漸恢復。

(1)Pluchino評分法通常使用Pluchino的方法進行評定，標準如下：①1級部分尾巴下垂；②2級完全尾巴下垂；③3級完全尾巴下垂和站立行走緩慢；④4級后肢部分癱瘓；⑤5級后肢完全癱瘓；⑥6級瀕死狀態。

(2)取材Lewis大鼠由10%水合氯醛腹腔麻醉后，左側臀部剪毛、消毒，分離出腦和脊髓，4%甲醒固定，縱向包埋，常規石蠟切片。

(3)染色與觀察蘇木精－伊紅染色觀察Lewis大鼠腦和脊髓神經組織切片淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞的浸潤情況。可見脊膜及中央管周圍有明顯的淋巴樣組織浸潤、增厚，脊髓白質內有細胞浸潤的小灶狀病變及靜脈周圍呈套袖樣浸潤。神經細胞有壞死，細胞核消失呈勻質小體，或細胞體消失留下一空隙，以及細胞周圍有圓細胞浸潤等。在腦組織中可見到腦膜增厚，淋巴樣細胞及單核細胞浸潤。室管膜及脈絡膜亦呈同樣變化。小靜脈及毛細血管周圍，則呈套袖狀細胞浸潤。腦實質內有小膠質細胞組成的浸潤灶。有些星狀細胞呈核碎裂、胞漿蒼臼、細胞變形等。LuxolBlue髓鞘染色法觀察Lewis大鼠腦和脊髓神經組織切片髓鞘脫失程度。

(1)動物選擇不同種屬動物對EAE敏感性不同，因而EAE的建立與選擇的動物種屬關系很大。經免疫遺傳研究發現EAE的發生受遺傳因素制約，EAE的易感性受免疫反應基因影響，它直接控制實驗動物對抗原刺激的免疫反應。因此，在選擇動物時需要尋找EAE模型的敏感動物，如SJL/J、BIOPL小鼠、Lewis大鼠、豚鼠、日本大耳白兔、新西蘭白兔、恒河猴和食蟹猴等都是良好的EAE敏感動物。

(2)抗原的種類、選擇和制備EAE的致腦炎抗原具有器官特異性，而沒有種屬特異性，存在所有溫血動物中樞神經系統的白質內。從始至今使用的致腦炎抗原的種類有同種型、異種型或同種異型溫血動物的全腦、脊髓組織勻漿或其中的白質，髓鞘蛋白脂蛋白，髓鞘堿性蛋白，用消化酶分解后的膚片，大腦內皮細胞膜以及MBP特異性T淋巴細胞。通常不同品種動物對同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同，并且不同來源的同一抗原的活性也有明顯差異。一般情況下，抗原性強弱依次為豚鼠脊髓＞大鼠脊髓＞牛脊髓，脊髓組織＞腦組織，豚鼠MBP>牛MBP。目前最被廣泛接受的是使用MOG35-55片段，其氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。MOG在髓鞘蛋白中含量很少，只占總髓鞘蛋白成分的0.01%-0.05%,但由于它存在于髓鞘膜和少突膠質細胞的最外層，故具高度免疫原性。因此，研究MOG誘導的EAE模型可以為更好的闡明MS的發病機制提供重要信息。近年來，用MOG誘導EAE逐漸成為國際上研究MS的主要模型。

(3)致敏方法致腦炎抗原的免疫途徑有多種，如皮下、皮內、肌肉、腹腔和靜脈注射。其中皮下多部位注射致腦炎抗原誘發EAE的發生率最高，因而常用的注射途徑是皮下注射。EAE的產生不僅與實驗動物和致腦炎抗原有關外，而且與致敏方法密切相關。由于致敏方法的不同，可誘導產生超急性、急性和慢性病程的EAE。具體實施方案如下：

①若給實驗動物一次注射大劑量致敏原和CFA,同時注射百日咳菌苗，動物免疫后7-8d發病，這就是超急性EAE;

②若給實驗動物一次注射較大劑量的致敏原和CFA,動物在注射后2周左右發病，這就是急性EAE;

③若給實驗動物間隔一周注射較小劑量的致敏原和CFA,急性起病后有緩解復發的病程，或急性EAE經不當治療也可有緩解復發，這些均是慢性復發性EAE。