離子交換層析實驗（四）

六、實例: 復雜蛋白質混合物的分離

采用離子交換層析分離復合蛋白質混合物的一個典型例子就是從乳清中分離蛋白質。它可以進行一定程度的工業化放大，但也可作為一個廉價的檢測體系用于離子交換劑的評價。實際上, 我們也已經通過這種蛋白質混合物來比較不同供應商所提供的離子交換劑的吸附能力（Hahnetal.，1998)。

1.牛奶的預處理

將牛奶在室溫下，以 4420 g 離心 30 min 進行去脂處理。再采用 5mol/LHCl 將脫脂牛奶的 pH 調節至 4.7。酪蛋白沉淀發生之后，將溶液進一步攪拌 30 min，以期沉淀徹底。再在 17700 條件下離心 30 min。得到乳清后，再以蒸餾水進行稀釋，直至溶液的電導率達到 2.7mS/cm。若稀釋過程使溶液的 pH 發生變化，應再按照上述方法調節 pH 至 4.7。最后，將所得乳清溶液以 0.45 的 Millipak-60 濾器 (Millipore,Bedford,MA，USA) 過濾處理, 用于下一步的層析分離操作。

2.層析條件

將陽離子交換樹脂裝填 HR10 柱和 HR16 柱 (GEHealthcare，Uppsala，Sweden)。

柱直徑分別為 30 mm/10 mm 和 35 mm/16 mm(高度/內徑)。層析用緩沖液為檸檬酸體系，用 I.0mol/LNaOH 調節 pH。以 Imol/LNaCl、20 mmol/L 梓檬酸再生，以 pH4.7、電導率為 2.7mS/cm 的 20 mmol/L 梓樣酸平衡。平衡緩沖液沖洗掉未結合的蛋白質后，用 NaCl 濃度持續增大的連續梯度洗脫結合蛋白質。

七、實例: 采用整體柱進行高分辨率的分離

一個令人印象深刻的高分辨率分離的例子是，用陰離子交換劑整體柱（PodgornikandPodgomik,2004) 分離猛過氧化物酶 (manganeseperoxidase，MP)。該分離過程在 3 min 內即可完成。

1.Mn 過氧化物酶的制備

在裝有 100 mL 氮源限制性培養基的 500 mL 錐形瓶中搖瓶培養黃孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)MZKIB-223(ATCC24725)(SJSftMS32 〇 C0 養基中含有 1mmol/LMn2+, 僅利于合成 MnP。培養 4 天后, 即當 MnP 的活力最高時, 收集 250 mL Rc/ir；y?? 扣菌液。隨后，過濾菌液，凍存過夜后融化，離心去除其中存在的黏性多糖類物質。

2.層析條件

采用含0.34：mL CIMQA(quaternaryamine)disk(BIASeparations，Ljubljana,Slovenia) 的 CIMdisk 整體柱分離 MnP 同工酶。以配備兩個泵的梯度 HPLC 系統進行實驗，其中進樣閥為 100/uL 不銹鋼上樣環, 將具有 10_光程的可變波長監視器設置為 280nm 或 409mn, 流量 10 uL, 通過 0.25 mm 的 I.D.PEEK 毛細管進行連接。用不同濃度 (10 mmol/L 到 Imol/L) 和不同 PH(4~6) 的乙酸鈉進行線性梯度洗脫分離同工酶, 流速 4 mL/min(圖 22.9)。

這種快速的純化方法可以在 2 min 內完成對亞型及兩種其他類型突變體的分離。該方法還適用于蛋白質的制備和分析。