實驗方法原理
離子交換色譜是將離子交換基因（CM、SP、Q、DEAE等）鍵合于一定的惰性載體（纖維素、交聯葡聚糖，交聯瓊脂糖等）之上，并以此作為固定相，依據樣品所帶電荷的不同，從而與固定相上的離子交換基團相互作用的程度不同而進行分離的一種色譜方法。離子交換色譜技術已廣泛用于蛋白質、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體、多糖等的純化。
離子交換劑是在載體上鍵合了一些離子交換基團，而離子交換基團在水溶液中通過電離釋放出游離的離子，這些離子可帶正電或帶負電，可以被溶液中的其它帶相同電荷的離子取代，并對離子交換劑有較強的結合力。結合力的大小不僅受離子與離子交換劑之間作用力的影響，而且主要受離子濃度的影響，這個過程中的作用力是靜電引力，離子交換的原理是靜電相互作用。
蛋白質在離子交換色譜上的保留時間取決于蛋白質在相應色譜條件下所帶靜電荷的多少，而蛋白質所帶靜電荷的多少是由蛋白質分子的pI和所處溶液環境的pH共同決定的。在酸性條件下，蛋白質帶正電荷；在堿性條件下，蛋白質帶負電荷。在陽離子交換柱上，只有pI大于流動相pH的蛋白質在柱子上保留，而pI小于或等于流動相pH的蛋白質不保留，即使它們的pI值彼此之間有差異，也都作為溶劑峰同時被直接沖洗出來。而被保留的蛋白質出峰順序則是pI小的先出峰，pI大的后出峰。在陰離子交換柱上情況則恰恰相反。
離子交換色譜過程分為四個階段：平衡-吸附-解吸附-再生，其中吸附和解吸附是主要階段，現以純化TNF過程中應用的Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF為例說明。
實驗材料 TNF
試劑、試劑盒 Tris-HCl EDTAPB緩沖液硫酸銨透析液氯化鈉
儀器、耗材 透析袋離心機離心管移液槍槍頭陰離子交換基質Q-Sepharose FF蛋白檢測儀陽離子柱SP-Sepharose FF試管
實驗步驟
一、試劑的配制
1. 配制pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液（或其貯備液，臨用時稀釋即可）濾后使用。
2. 配制pH7.5 20 mmol/L的PB緩沖液，過濾后使用。
二、操作步驟
1. 樣品的預處理
2. 樣品的平衡
將實驗一中50%飽水硫酸銨沉淀、離心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍體積的pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA的緩沖液中，4℃攪拌透析24 h，中間換透析液3～4次，4℃ 12 000 rpm離心15 min，收集上清，測定蛋白濃度，記錄體積。
3. 陰離子柱Q-Sepharose FF的平衡及上樣
取陰離子交換基質Q-Sepharose FF裝柱，柱體積5.4×20 cm用pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA 緩沖液流洗平衡層析柱，調整好蛋白檢測儀的量程及記錄儀靈敏度。將收集的上清液以8 ml/min流速上樣。平衡緩液沖直至流出液吸光值恢復至基線。收集穿過峰，量體積，測蛋白含量。
4. 洗脫
洗脫液A為pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA緩沖液，洗脫液B為含終濃度為1 mol/L NaCl的A液進行線性梯度洗脫（根據純化條件設定的純化工藝），收集各洗脫峰量體積，測蛋白濃度，進行SDS-PAGE或進行活性鑒定TNF所在峰。
5. 將活性峰用pH7.5 20 mmol/L PB透析24 h，中間換液3次。離心，取上清并量其體積，測蛋白濃度。
6. 陽離子柱SP-Sepharose FF的平衡及上樣
取陽離子交換基質SP-Sepharose FF裝柱，柱體積2.5×10 cm，用pH7.5 20 mmol/L PB緩沖液流洗平衡層析柱，調整好蛋白檢測儀的量程及記錄儀的靈敏度，將透析、離心后的TNF的峰液以4 ml/min的流速上樣，用平衡液洗至基線，收集穿過峰，量體積，測蛋白濃度。
7. 洗脫
陽離子層析柱SP-Sepharose FF的洗脫液A為pH7.5 20 mmol/L PB，洗脫液B為含1 mol/L NaCl的A液進行線性梯度洗脫，收集各洗脫峰，量體積，測蛋白質濃度，進行SDS-PAGE或活性鑒定。
8. 后處理
進行TNF的純度、活性等鑒定，按要求分裝加賦形劑冷凍干燥后制成一定效價的TNF產品。