時間分辨熒光技術有基于時域和基于頻域兩種測量方法。由于時間分辨結果數據包含有比穩態熒光數據更多的信息,近年來,時間分辨熒光技術已成為生物化學與生物物理領域的主要研究工具之一。熒光壽命成像技術可以同時獲得分子狀態以及空間分布的信息,在生物學和醫學領域也得到了越來越廣泛的應用。以下將從原理、儀器及應用等方面,簡要介紹時間分辨熒光以及熒光壽命測量技術。
1，熒光及熒光壽命的基本原理
分子吸光后去活化的原理與過程,可以直觀的用Perrin2Jablonsky圖表示(圖1是一種簡化表示)。簡言之,分子中處于單線態基態電子能級S0的電子,依據Frank2Condon規則吸收一定波長的光子后,被激發至單線態激發態電子能級(一般是S1態)中的某一振動能級,這一過程約10-15s;在經歷短暫的振動弛豫過程后(約10-12～10-10s),會有大量電子在S1態的最低振動能態積累。這一狀態的電子會有幾種釋放能量,回到基態S0態的途徑,包括振動弛豫在內的這些途徑被統稱為去活化的過程。若能量釋放的過程中伴隨著光子的放出,則稱為輻射去活;若只是通過碰撞等途徑釋放能量,而沒有光子放出,則稱為無輻射去活。
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熒光發射即為一種常見的輻射去活過程,它通常是指電子發生自S1態至S0態的躍遷,同時放出光子的過程,這一過程的時間通常在10-10～10-7s。利用光學儀器檢測熒光發射的強度隨時間的變化,即可得到體系的熒光壽命信息。
無輻射去活過程有以下幾種途徑:內轉換指的是電子在具有相同多重度的電子能態間發生躍遷的過程,時間通常在10-11至10-9s;系間跨越指的是電子在不同多重度的能態間發生躍遷的過程,如單線態S1至三線態T1的躍遷,其時間通常在10-10～10-8s;熒光猝滅指的是激發分子通過分子間的相互作用和能量轉換,從而釋放能量的過程,也稱作外轉換。這些無輻射去活過程在決定體系的熒光壽命時起非常重要的作用。
此外,電子躍遷至T1態后,也有一定幾率以放出光子的形式躍遷至S0態,稱作磷光發射;或再次系間跨越回S1態,并放出一個光子回到S0態,稱作延遲熒光。限于篇幅,這兩類發光情況不在此作討論。
2，熒光衰減曲線及熒光壽命
在激發光源的照射下,一個熒光體系即向各個方向發出熒光;當光源停止照射時,熒光不會立即消失,而是會逐漸衰減至0。基于以上原理,可以對一個理想體系的熒光衰減進行嚴格的數學推導。
對于熒光物質A的稀溶液,設其濃度為[A](mol·L-1),假設所有A分子所處的環境近似,則溶液中所有A分子的熒光衰減途徑相同。有一束時間很短的脈沖光,若其持續時間與過程中涉及的速率常數相比可忽略不計,則可認為其時間寬度為0,這種理想的線光源被稱作δ2脈沖。以δ2脈沖激發上述溶液,由于光吸收與振動弛豫的時間很短,則可認為在時間為0時,一定數量的A分子就通過吸收光子,而到達了激發態S1,濃度用[1A3]表示。這些處于激發態的分子,會通過輻射(在這里即指熒光)或無輻射的途徑返回基態S0,其速率常數分別用kSr和kSnr表示。此過程可與一級反應類比,激發態分子的衰減速率可用式(1)表示:
-d[1A3]dt=(kSr+kSnr)[1A3](1)
對式(1)進行積分,即可得到時間t時激發態分子濃度與初始激發態濃度[1A3]0間的關系:
[1A3]=[1A3]0exp-tτS(2)
式中的τS稱作激發態S1的壽命,用式(3)表示:
τS=1kSr+kSnr(3)
熒光強度IF與激發態分子的濃度以及熒光輻射去活的速率常數成正比:
IF(t)=kSr[1A3]=kSr[1A3]0exp-tτS(4)
用熒光儀器測量時,觀測到的熒光強度IF還與儀器的各參數有關。因此,熒光強度與激發態壽命的關系可簡單表示為:
I(t)=αexp-tτ(5)式(5)
表明,以δ2脈沖作為激發光源的單一體系中,熒光強度呈單指數衰減。而觀測到的熒光壽命τ與S1態的壽命τS等價,不僅受熒光發射速率的影響,還受各種非輻射過程的影響,所以直接測得的表觀熒光壽命也稱作自然壽命。
對于復雜體系,由于其中各熒光物質的性質或所處微觀環境不同,整個體系的熒光衰減曲2線為多個指數衰減函數的加和,稱多指數衰減:
I(t)=∑iαiexp-tτi(6)
以上的熒光衰減曲線,是基于激發光源為理想線光源δ2脈沖的情況下得到的(圖2)。
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實際上,任何實際光源都有一定的寬度,因此在實際應用中,上述表達式還需要做進一步修正。若將激發光源的強度表示為時間的函數E(t),則檢測到的信號R(t)可表示為E(t)與δ2脈沖響應I(t)間的卷積分:
R(t)=E(t)aI(t)=∫t0E(t′)I(t-t′)dt′(7)
根據以上理論推導得到的結論,可設計熒光壽命的檢測儀器,解析測量結果,進一步得到體系的動力學信息。