等溫多自配引發擴增(IMSA)即isothermal multiple self-matching-initiatedamplification，是對目前核酸分子檢測技術手段的改進和補充，具有簡單、快速、高靈敏性高特異性的優勢。IMSA最大特點就是，在等溫核酸擴增過程中會產生多倍數的能自我配對繼而引發循環擴增的特殊核苷酸結構。這種結構的大量產生富集，使得隨后循環擴增引發幾率明顯增加，繼而使得擴增效率提高，最終使得檢測靈敏度提升。就理論上而言，IMSA的靈敏度應該要高于LAMP的靈敏度。在結果判定上，同LAMP技術一樣，IMSA能夠通過觀察副產物焦磷酸鎂白色沉淀、于擴增前或后加入顯色劑觀察顏色變化等簡單措施進行判定。
在引物設計上，IMSA與LAMP類似都利用了混合式引物的設計思路。所謂混合式引物，是指一條引物由目的基因同一條鏈的兩段序列組成，其前段堿基順序與靶位鏈的序列反向互補，后段則與靶位鏈序列同向。因此，混合式引物的擴增子(amplicon)3’端序列可與中間某段序列互補配對，故又稱為自我配對結構(self-matchingstructure)。IMSA引物組成，如附圖1所示。一共有三對引物，分別是一對外引物DsF/DsR，一對內引物FIT/RIT和一對莖引物SteF/SteR，其中外引物和內引物均是混合式引物。六條引物特異性地識別靶基因的七個位點，分別是F3、F2、F1、T、R1、R2和R3(附圖1所示)。DsF由F1c和F3序列組成(F1c為F1的反向互補序列，下同)，DsR由R1c和R3序列組成，FIT由Tc和F2組成，RIT由T和R2組成，SteF即R1c序列，而SteR即F1c序列。
IMSA擴增借助于鏈置換酶的催化作用，如需建立對RNA模板的擴增，還需利用AMV逆轉錄酶建立逆轉錄IMSA即RT-IMSA。IMSA的反應緩沖液可利用國產等溫擴增緩沖液(廣州迪澳公司等生產)，其成分主要有dNTPs、甜菜堿、MgSO4和10×Bst 酶緩沖液等。添加IMSA六條引物后，通過反應條件優化(如溫度、引物比例、酶的用量等)，可建立最優化IMSA反應體系。最優化反應條件是：體系總體積為25μL，其中，4μL RNA模板、12.5μL 2×RM、1.0μL Bst 2.0 DNA聚合酶(8U/μL)、0.4μL AMV逆轉錄酶(10U/μL)，對應基因的6條引物各1μL(引物濃度：DsF、DsR均為5μM，FIT、RIT均為20μM，SteF、SteR均為40μM)。反應條件63°C，時間1h。
IMSA擴增原理可分為兩個階段：一是原始自我配對結構(self-matchingstructure，SMS)的生成；二是基于SMS的自我循環擴增(cyclingamplification)。附圖2所示為原始SMS的生成階段(以其中一條靶位鏈的擴增做演示，另一條互補靶位鏈擴增類似)。首先，引物DsF中F3段、FIT中F2段和SteF分別識別靶位鏈上的F3c、F2c和R1位點，而后在Bst鏈置換酶的作用下引物不斷延伸。當DsF延伸至FIT時，鏈置換酶會將FIT的延伸產物置換出來；FIT同樣也會置換出SteF的延伸產物，但該產物對后續擴增無意義故不考慮。雙鏈結構的DsF延伸產物會在甜菜堿作用變性成單鏈。然后，DsR和RIT分別識別DsF延伸產物的R3c和R2c位點，同樣也分別識別FIT延伸產物的R3c和R2c位點。最后，在酶的置換作用下，可生成四條原始的自我配對的結構(SMS-1至SMS-4)。這四種原始SMS，因其3’端序列均與其內部序列互補配對故能自我配對形成閉合環狀的DNA結構。
附圖3(A-D)所示為基于原始SMS的循環擴增階段。每條SMS在完成自我配對后均可在酶作用下延伸形成C環樣(C-clamplike)結構。同時，在引物和酶的協同作用下，四種SMS可獨立地激活循環擴增。附圖3(A)、(B)、(C)和(D)分別為SMS-1、SMS-2、SMS-3和SMS-4的循環擴增示意附圖。此階段，IMSA產物主要是長雙鏈C環樣結構。
在產物檢測上，同LAMP技術一樣，IMSA能夠通過對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、觀察副產物焦磷酸鎂白色沉淀、于擴增前或后加入顯色劑觀察顏色變化等簡單措施進行判定。主要有：(1)瓊脂糖凝膠電泳法；(2)目測副產物焦磷酸鎂沉淀法；(3)顏色判定法(借助于SYBRGreen、鈣黃綠素、羥基萘酚藍等染料)；(4)實時濁度法(依賴Loopamp實時濁度儀)；(5)實時熒光法(借助熒光采集儀器)。
IMSA是基于LAMP擴增原理和巢式PCR引物設計理念建立起來的新型等溫擴增技術。IMSA與LAMP對比起來存在很大的相似性，尤其在產物檢測或結果判定上二者是一樣的。但是，IMSA跟LAMP還是存有明顯差異性，主要體現在引物設計和擴增原理上。在引物設計上，IMSA跟LAMP有三點不同：(1)IMSA是六條引物識別七個位點，而LAMP六條引物識別的是八個位點；(2)IMSA的外引物是混合式引物，引入了莖引物的序列，而LAMP的外引物無此設計；(3)IMSA的內引物上游的5’端序列與下游的5’端序列是互補配對的，而LAMP的內引物無此設計。正是因為有上述引物設計差異，IMSA明顯會產生比LAMP多的能自我配對的結構(這種結構在LAMP中稱為莖環結構)。在擴增原理上，IMSA跟LAMP比同樣存在三點不同：(1)IMSA的原始SMS生成階段，能產生四條大小不等的SMS，而LAMP的初始階段只能生成一條SMS即莖環結構；(2)在IMSA反應中，內外引物在整個擴增過程都發揮著作用，而LAMP的外引物只在初始階段起富集模板作用；(3)IMSA反應中六條引物組合最佳比例經驗證為DsF/R:F/RIT:SteF/R=1:4:8而LAMP的最佳比例為F3/B3:FIP/BIP:LoopF/LoopB=1:8:4。在應用上IMSA和LAMP具備同樣的優點：(1)特異性強；(2)靈敏度高，而且IMSA在對某些靶位檢測時會表現比LAMP更高靈敏度的優勢；(3)擴增效率高；(4)結果易判讀；(5)可擺脫儀器，適合現場檢測；(6)檢測時間短。
IMSA技術是本研究自行發明的新型等溫擴增技術。IMSA不僅擁有LAMP檢測技術類似的應用優點，在引物設計和擴增原理上還具有其獨有的特點，使得其具備比LAMP更高檢測靈敏度的潛力。該技術一定程度上能打破日本LAMPZL在我國的應用限制，使其更好地服務于我國的傳染病防控、食品安全檢測和環境物種保護等各個領域。目前，IMSA技術已經申報國家ZL，ZL申請號為201310370202.2，相信該技術的出現能為現有檢測技術注入新的血液。
【附圖及說明】
附圖1IMSA引物組成及其位點
附圖2 IMSA原理的原始自我配對結果的生成階段示意圖
附圖3(A)
IMSA反應中基于SMS-1結構的循環擴增示意圖。FIT識別SMS-1自我配對延伸后形成C環樣結構上的F2c位點，不斷延伸并打開雙鏈。SMS-1延伸結構的3’端又可進行自我配對，不斷延伸至FIT時可將FIT的延伸產物置換出來，生成新的自我配對結構。新的SMS同樣完成自我配對后在RIT引物作用下經過延伸、解鏈、配對、再延伸和再置換的過程后可生成原始SMS-1。而原始SMS-1延伸產物在RIT和FIT引物協同作用下不斷延伸。依次循環以上過程，可形成基于原始SMS-1衍生的長鏈C環樣結構。
附圖3(B)IMSA反應中基于SMS-2結構的循環擴增示意圖。FIT識別SMS-2自我配對延伸后形成C環樣結構上的F2c位點，不斷延伸并打開雙鏈。SMS-2延伸結構的3’端又可進行自我配對，不斷延伸至FIT時可將FIT的延伸產物置換出來，生成新的自我配對結構。新的SMS同樣完成自我配對后在DsR和RIT引物作用下經過延伸、置換、解鏈、配對、再延伸和再置換的過程后可生成原始SMS-1和SMS-2。而原始SMS-2延伸產物在DsR和RIT引物協同作用下不斷延伸。依次循環以上過程，可形成基于原始SMS-2衍生的長鏈C環樣結構。
附圖3(C)
IMSA反應中基于SMS-3結構的循環擴增示意圖。FIT和DsF分別識別SMS-3自我配對延伸后形成C環樣結構上的F2c和F3c位點，不斷延伸并打開雙鏈，同時FIT延伸產物被置換形成新的SMS。SMS-3延伸產物的3’端又可進行自我配對，不斷延伸至DsF時可將FIT的延伸產物置換出來，生成新的SMS。兩個新的SMS同樣完成自我配對后，經過延伸、置換、解鏈、配對、再延伸和再置換的過程后可生成原始SMS-1和SMS-3。依次循環以上過程，可形成基于原始SMS-3衍生的長鏈C環樣結構。
附圖3(D) IMSA反應中基于SMS-4結構的循環擴增示意圖。FIT和DsF分別識別SMS-3自我配對延伸后形成C環樣結構上的F2c和F3c位點。經過延伸、置換、解鏈、配對、再延伸、再置換和再解鏈的過程后可生成原始SMS-1至SMS-4。依次循環以上過程，可形成基于原始SMS-4衍生的長鏈C環樣結構。