等電聚焦和二維凝膠電泳實驗

樣品緩沖液羥乙基二硫化物細胞裂解緩沖液SDS-PAGE 現成溶液二硫蘇糖醇碘乙酰胺

等電聚焦電泳系統二維SDS-PAGE 多凝膠系統恒溫循環器IPG 干膠條溶脹盤上樣杯旋轉搖動混合器

一、等電聚焦的基本原理

等電聚焦 (IEF) 是一種能根據分子內的質子接受點的 pKa 值所決定的電荷量分離兩性分子 (如蛋白質和肽類) 的電泳分離方法。對于蛋白質和肽類而言，這些點位可以位于 N 端和 C 端的自由氨基及羧酸，也可以位于精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基的側鏈。等電點是兩性分子特有的物化參數，它是分子凈電荷為零時的 pH。等電聚焦具有極高的分辨能力，包括分離能夠改變電荷的蛋白質翻譯后修飾 (如磷酸化作用、乙酰化作用/去乙酰化作用）。雖然這一方法可應用于若干類型的兩性復合物的分離，但章節將只討論蛋白質分離的方法論。

等電聚焦電泳樣品的制備需要高濃度離液劑、兩性離子去污劑、還原性巰基及載體兩性電解質，以防止在蛋白質之間形成聚集物和復合物。制備高分辨率的等電聚焦電泳, 必須確保樣品中不存在非蛋白質離子，因為需要保證高電阻以在最小電流的狀態下產生高電場 (8000~10000V)。通常用蛋白質沉淀法減少此種污染物 (見本章 3.2 節）。理想情況下，等電聚焦電泳樣品中的唯一離子便是蛋白質本身。隨后，該樣品便用于含有與樣品相同添加物的等電聚焦凝膠中，并在電場中分離。在蛋白質到達其等電點后，將凝膠孵育在 SDS 緩沖液中，再根據蛋白質表觀分子質量，用 SDS-PAGE 平板凝膠進行分離（分子質量是主要影響因素, 但也受到疏水性影響, 并且蛋白質形狀也有著較小影響）。

用于二維凝膠電泳的現代等電聚焦法采用薄聚丙烯酰胺凝膠作為分子篩，該分子篩具有固定的 pH 梯度（IPG)。這種凝膠中的丙烯酰胺濃度較低（丙烯酰胺總量通常為 4%~5%), 因為此基質不能對高分子質量蛋白質有所限制。將蛋白質加入此基質中，再加上電場。在 pH 梯度上低于 (也就是酸性強于）自身 pi 的蛋白質將帶正電荷，并向電場的陰極移動。相反地，在 pH 梯度上堿性強于自身 pi 的蛋白質將向電場的陽極移動。Pl 表示蛋白質電中性時的 pH，因此當蛋白質在 pH 梯度上的值等于 pi 時，不受電場影響。

這樣一來，蛋白質便會停止移動，并且牢牢保持在與自身 Pl 相等的 pH 處。這一方法具有得天獨厚的聚焦效果—當蛋白質從其 Pl 點處擴散時，便會帶上電荷，從而電場又會迫使其移回等電點。

在等電聚焦過程的最后，蛋白質便會高度聚集在其等電點上，因此探測時靈敏度非常高。即使是微小的電荷差異也能區別開，并且可以采用更大的分離距離和更小的梯度間隔來提高分辨率 (HovingetaL,2000)。如有需要，還可以用蛋白質標準品標定校準曲線來估計蛋白質的等電點。

等電聚焦的 pH 梯度類型

1.載體兩性電解質

在由自由溶液中的混合兩性緩沖液構成的 pH 梯度中分離蛋白質這一概念，是由 Vesterberg 和 Svensson(1966) 提出的,Vesterberg 在幾年后便將這一概念轉化為可行的方法 (VeSterberg，1972)。由于自然形成的氨基酸和多肽在其等電點時具有很弱的緩沖能力，所以緩沖液需要通過化學方法進行合成。

Ampholines(兩性電解質) 是首批以此為目的而投入市場的試劑，該試劑是脂肪族寡氨基酸和寡碳酸的混合物，包含 600~700 種不同的同系物，這些同系物的等電點為 pH3~10。這些復合物在等電點時具有很強的緩沖能力，并能在電場的作用下形成 pH 梯度。混合物的分子質量小于 IkDa 時最適宜，并且因為高親水性不會與蛋白質結合。

等電點范圍明確后，將有助于提高 pH 梯度相差較小的混合物的分辨率。

載體兩性電解質是近年發展起來的，與 Amphonlines 試劑相比，它們是由不同種的試劑合成的，并可從多種商業渠道中購得。盡管這些產品都能在電場作用下形成 pH 梯度，但它們的 pH 梯度具體分布、緩沖力的分布以及同系物數量卻是不同的（Righettietal.，2007), 因此它們的聚焦模式也不盡相同。

基于載體兩性電解質的等電聚焦大多是在聚丙烯酰胺凝膠中進行的，O’Farrell(1975) 提出的最初的二維凝膠電冰過程在薄凝膠管 (一維時為柱狀膠) 中的載體兩性電解質梯度中完成等電聚焦。但是這些長軟型的凝膠不易操作，且隨著電泳時間增加，pH 梯度也會變得不穩定, 從而引起陰極漂移。雖然一些實驗室仍然采用載體兩性電解質技術，但是這一技術方法大多被 IPG 膠條所替代，我們將在下面討論 IPG 膠條。

2.固定的 pH 梯度

隨著用于等電聚焦的聚丙烯酰胺基質中固定 pH 梯度這一概念的引人，二維凝膠電泳在方法論上有了重要的發展（Bjellqvistetal.,1982)。這一重要的技術發展克服了載體兩性電解質系統的一些不足, 如梯度漂移 (特別是在陰極區）、機械不穩定性以及不同次電泳之間和實驗室之間的技術差異。IPG 膠條技術極大地推動了二維電泳方法論, 并大大提高了實驗室內部及不同工作組間的重復性 (Gorgaal.，2000;2004)，如今已經成為等電聚焦的備選方法，并可從一些商業渠道獲得。

在現代 IPG 膠條技術中,pH 梯度是由酸性和堿性緩沖組組成的。這些緩沖組是在制備凝膠時與聚丙烯酰胺基質共聚合而成的。只需要不到 10 種不同的具酸性和堿性 PKa 值的丙烯酰胺衍生物便足以獲得任意的 pH 梯度。需要制備 2 種含有計算好的丙烯酰胺衍生物混合體的單體溶液: 酸性梯度端溶液的制備需加入一部分甘油用以在倒膠時穩定梯度。這些 PH 梯度凝膠的鋪制是以共價結合的薄膜襯底為支撐的。在凝膠制備完成后，需用蒸餾水將聚合催化劑和非反應混合物從介質中洗去，以便產生等電聚集所必需的極低電導 (Westermeier，2005)。

IPG 膠長期保存時需干燥，并需在使用前不久進行再水化處理。IPG 膠的主要好處在于不存在陰極漂移問題，因為梯度是固定于基質上的。IPG 膠主要應用于變性條件下的等電聚焦，作為高分辨率二維凝膠電泳的第一維所使用; 其中仍然使用載體兩性電解質，并且為了提高導電性和蛋白質的溶解度，在樣品中和 1PG 膠的再水化溶液中都要加人載體兩性電解質。

如今可以從一些供應商處購買到預制的 IPG 膠條，這些膠條具有各種長度和 PH 梯度，可以實現蛋白質裂解產物中選定的蛋白質組分的最優化分離與呈現。尤其是，膠條的 pH 梯度有非常寬的范圍 (如 pH3~11)，有中間范圍 (如 pH4~7、pH7~11)，還有狹窄范圍 (如 pH4~5、pH5.5~6.5)。膠條長度同樣非常多樣，短至 7 cm, 長至 24 cm。典型膠條寬度為 3 mm，平均厚度約為 0.5 mm(圖 30.2)。為了實現預期實驗目的, 需要挑選具有最優 pH 范圍和長度的膠條 (Hovingetal.,2000)。例如，7 cm、pH3~11 的 IPG 膠條可以為小樣式凝膠提供最好的范圍，但是總體來說，它們為蛋白質組范疇的、基于探索性質的實驗提供的分辨率和靈敏性是最低的。

IPG 膠條提供幾種樣品上樣模式。再水化上樣和杯狀上樣是兩種主要使用的方法，還有主動再水化的修改方法和紙橋上樣（圖 30.3)。本章 3.3 節和 3.4 節對這些方法有非常具體的介紹。樣品上樣方法的選擇取決于 pH 梯度的類型和樣品。因為 IPG 膠條有一個平整的表面, 所以如果需要, 可以應用于水平平板 SDS 凝膠電泳。

SDS-PAGE

Laemmli(1970) 描述的 SDS-PAGE 在很長一段時間內作為各種生化分析中分辨完整蛋白質的備選方法。這主要是因為對于疏水性很強的蛋白質,SDS 是最好的增溶去污劑，所有的蛋白質，包括堿性很強的蛋白質，都向同一方向移動, 分離取決于各自的表觀分子質量 (通常稱為分子質量）。

1.分離原理

當將過量的 SDS 加入到蛋白質溶液中時，蛋白質會形成一些陰離子微粒，其每個質量單位帶一個恒定的凈負電荷。蛋白質的三級結構和二級結構被破壞，肽鏈被解開。為了使肽鏈完全展開，需要使用諸如 2_巰基乙醇或二硫蘇糖醇等還原劑把半胱氨酸之間的二硫鍵打開。Ibel 等 (1990) 認為, 這些復合物的多肽表面部分被覆蓋，部分被打開，猶如項鏈一般。在電泳過程中所有的 SDS 微粒都移向正極, 其電泳遷移率主要取決于分子質量，但也會受蛋白質疏水性的影響。如果將蛋白質的遷移距離對表觀分子質量的對數作圖，就會得到一條在線性范圍內的 S 形曲線。在共遷移的蛋白質分子質量標準的輔助下，就可以估算多肽的分子質量。

2.膠的類型

一般來講，SD&PAGE 可以在各種各樣的基礎緩沖體系中進行；但是，LaemmIi(1970) 創立的不連續緩沖體系是最常用的體系, 在膠中使用 PH8.8 的 Tris-HCl, 在電泳緩沖液使用 SDS^Tris-甘氨酸。對于一維分離，pH6.8 的低濃度積層膠使樣品緩慢進入膠內，而不發生聚集，而且在分離起始時有壓縮條帶的效果。但是, 在二維凝膠電泳中通常不使用積層膠，因為蛋白質已被預分離，而且已經在 3 mm 寬的 IPG 膠條內被高效濃縮 (詳見本章 3.6 節)。

標準的基質是含有 12.5%T(全部為丙稀酰胺) 和 2.6%C(用于交聯的雙丙烯酰胺) 的均一膠層。但一些應用中對于確定的范圍需要精確分離。例如，對于高分子質量蛋白質需要更低的％T; 而對于低分子質量蛋白質，更高的會有更好的解析度, 所以濃度要提高。梯度 SDS-聚丙烯酰胺凝膠可以提供更大動態范圍的分辨率, 但是其灌膠的一致性和可重復性是極大的挑戰，但這些要求對于使用二維凝膠的定量蛋白質組學是至關重要的。多孔梯度凝膠顯示出更寬的分子質量線性范圍, 并且可提高一些較難解析的蛋白質的分辨率, 如糖蛋白。

SDS 電泳可在夾在玻璃板中的盒式垂直裝置中運行，也可在水平平面上進行。膠的厚度為 1.5~ 0.5 min。較厚的凝膠在力學上更加穩定，但是更難染色，而且會產生額外的樣品損失，對隨后的質譜分析也會產生額外的背景噪聲。較薄的凝膠更易有效地冷卻，因此電泳可以進行得更快從而有更好的分辨率。

相對于過去幾十年中二維凝膠流程取得的進展，二維 SD&PAGE 分離幾乎沒有什么變化。垂直電泳系統的使用更普遍，同時跑 1 塊或 12 塊甚至更多塊膠的設備也已經出現。在歷史上水平平板裝置也是可行的, 而且因其低試劑消耗量 (如 SDS 電泳緩沖液）、樣品的處理方法以及較短電泳時間帶來的提高分辨率的潛力，現在有復興的跡象。一些進展包括: 使用有彈性的塑料支持物 [包括用于差異凝膠電泳 (DIGE) 和其他基于熒光的技術的弱熒光介質], 用于同時灌制多塊可重復的丙烯酰胺梯度和不同丙烯酰胺配方的凝膠的特別裝置，以增加凝膠的保質期和耐用性。

堿性 pH 梯度分辨率的提高

相對于酸性 pH 梯度, 堿性 pH 梯度的高分辨率等點聚焦更具有挑戰性，這既是由于陰極漂移的作用，又是由于維持蛋白質可溶性的還原劑的丟失（DTT 是弱酸, 在 pH 大于 8 時帶電，因此會與梯度的堿性區域分離）。陰極漂移作用最早通過引人非平衡 pH 梯度電泳 (NEpHGE) 得到解決 (OFarrelletal.,1977)。但是在 pH 大于 8 時還原劑丟失的問題仍然存在，而且由于半胱氨酸不再受到保護，導致多肽與尿素發生非特異反應、肽段背向折疊 (backfolding) 和聚集，造成二維凝膠堿性區域中蛋白質點的偽跡 (artifact) 和水平拖尾（streaking)。

用膦類化合物，如 TBP 或 TCEP 替換巰基試劑可以部分防止這類效應，但是由于這些試劑在電場中不穩定，會產生額外的偽跡。在等電聚焦之前，用碘乙酰胺、乙烯基吡啶或單體丙烯酰胺預先將蛋白質烷基化，都會因多肽烷基化不完全及等電點的變化而產生額外的偽跡。

過量使用羥乙基二硫醚（hydroxyethyldisulphide,HED)[商品化后商品名為 DeStreak(GEHealthcare)] 提供了 pH 下保持疏基處于還原狀態（通過質量作用）的方法，顯著提高了使用 IPG 膠條的堿性等點聚焦電泳的分辨率 (Olssonetal.,2002)。特別是在陽極樣品人口聯合使用上樣杯上樣或紙橋上樣時效果更佳，因為上樣時堿性蛋白質都帶著相同的酸性電荷進入梯度膠條，然后向陰極移動從而達到等電點 (而不是令它們向兩個方向都移動）。

當蛋白質進入到 IPG 膠條時，半胱氨酸側鏈上的巰基會立即被氧化成高度穩定的二硫化物混合物。這是一種高特異性的，可以阻止不需要的副反應的平衡反應（圖 30.4)。

使用 DeStreak 方法制備樣品時可以采用小量的 DTT，那么蛋白質便可在聚焦前保持還原狀態。然而需要注意的是，過量的 DTT 會將 HED 還原成 2-巰基乙醇, 這會導致更多拖尾①。

差異凝肢電泳

即便 IPG 膠條重復性越來越高，樣品制備和電泳條件更加嚴格，凝膠之間還是存在差異。差異表達蛋白質組實驗的成功依靠對單獨采集 (生物學上的) 樣本的重復的測量，同樣也需要技術上的重復 (對同一生物樣本的重復測量）以控制分析中產生的差異，如樣品采集、處理和凝膠之間的變化。通過運用 DIGE 技術 (FriedmanandLilley,2009;LilleyandFriedman，2004;Unluetal.,1997) 可以解決這些方面的挑戰。

1.染色和檢測

近來，二維凝膠電泳所用的熒光染料在發展和應用上獲得了重大進步。這些染料用于檢測和定量溶解在凝膠中的完整蛋白質種類。熒光染料特別提供了檢測的敏感性，其敏感程度至少大于等于銀染法（約 Ing)，并且還將豐度的線性動態范圍極大地提高了 3~4 個數量級 (銀染和考馬斯亮藍 R-250 染色法通常提供低于 1 個數量級的動態范圍）。

2.DIGE 和定量分析算法

1997 年，DIGE 法開始使用 (Unluetal.，1997)，此法將混合樣品的熒光標記的動態范圍與靈敏度應用于同一塊膠中，排除了共分析樣本中的分析性偏差 (幾種凝膠之間的）。

現在這一方法也能在一系列 DIGE 膠中應用，利用混合的樣本內對照，使遷移模式配準成為可能，從而標準化豐度比（abundanceratio)，為多變量實驗提供了非凡的統計支撐 (KarpandLilley，2005)。

簡而言之，這一方法要求事先用光譜區別明顯的熒光染料 (Cy2、Cy3 和 Cy5) 標記多種樣本，然后將樣本混合并在同一二維凝膠中分析。這一方法能排除幾種凝膠之間的偏差，并且相互獨立的突光影像也能被單獨記錄，用于單個分辨特征 (resolvedfeature) 中的蛋白質豐度變化的直接定量（圖 30.5)。這里用到了兩種不同的標記概念:「最少量」標記，即將占蛋白質總量約 5% 的賴氨酸中的 e-氨基進行標記廣充分」標記，即將蛋白質混合物中所有可標記的半胱氨酸「充分飽和」地進行標記。

在一系列含有不同的由 Cy3 或 Cy5 標記的凝膠中分析用 Cy2 標記的內參照時，DIGE 法最見成效，并有統計依據。重要的一點是，該 Cy2 標記的內參照是由實驗中所有樣本等量混合而成，并在多凝膠實驗的每一塊凝膠中都存在。由于個體樣本（由 Cy3 或 Cy5 標記) 與等份的 Cy2 基準混合物相混合，每種分辨特征 (resolvedfeature) 便可直接與凝膠中 Cy2 基準混合物中的同源特性（cognatefeature) 聯系起來。凝膠中的 Cy3:Cy2 與 Cy5:Cy2 之間的各種比例便能在不受幾種凝膠之間偏差的干擾之下算得，這些比例可用于實驗中另一些樣本中這一特性的所有其他衡量標準，不但技術性 (分析性) 誤差極小，而且有著強有力的統計學功效 (KarpandLilley,2005)。

DIGE 法也直接適用于多變量統計分析之中，如主成分分析和系統聚類。這些附加的統計工具能夠有效地幫助人們發現一組實驗樣本中的差異。重要的是，還能幫助確定差異中的主因素是否能夠描述生物性，或者能夠揭示樣本之間未曾預料到的 (或是在準備樣本時被帶入的) 差異，或者能夠精準定位出能對實驗刺激或分類作出集體反應的蛋白質亞群 [如見 Franco 等（2009);Friedman 等（2006;2007);Hatakeyama 等（2006);Suehara 等 (2006)。綜述見 Friedman 和 Lilley(2009);Lilley 和 Friedman(2004)]。

3.軟件分析工具

現在，一些軟件程序能輔助完成二維凝膠實驗 (無論是 DIGE 還是其他) 的定量分析。

這些程序最大的區別，便是在探測蛋白質特性 (界線）和幾種凝膠之間校準（aliSnment)/配準 (registration)(如基于載體的圖像變形）時的算法有所不同。總體而言，這些程序都提供了強有力的伴有單變量 (如 f 分布檢驗和方差分析) 和多變量 (如主成分分析和系統聚類）的統計分析的分析工具, 非常利于估量個體蛋白質特性和整體表達模式的豐度變化，該類模式能夠將描述生物學表型的變化和那些在實驗中未預料的偏差辨別區分。

二、方法

蛋白質樣品制備

穩定的樣品制備對于任何成功的生物分析性測定都是至關重要的。為了增加實驗的重復性, 并將預期外的變異降至最小，使用的緩沖液和材料都應該是質量最好的，并且在采購時需特別小心。應該使用小分子蛋白酶和磷酸酶抑制劑，如抑肽酶 (aprotinin)、亮抑肽酶 (Ieupeptin)、胃蛋白酶抑制劑 (pepstatinA)、木瓜蛋白酶抑制劑 (antipain)、4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟 (AEBSF)、鉺酸鈉（sodiumorthovanadate)、岡田酸（okadaicacid) 及微囊藻素 (microcystin) 等 (或采用這些小分子抑制劑的商品化試劑盒）。值得注意的是，不要采用會在二維凝膠中溶解的抑制劑 (如大豆胰蛋白酶抑制劑)①。

(1) 只要樣品隨后會沉淀以移除非蛋白質離子組分 (可嚴重干擾等電聚焦的成分, 詳見本章 3.2 節）, 則基本上可以使用任何一種蛋白質提取緩沖液。隨后用一種與二維凝膠相兼容的緩沖液重懸樣品。在許多情況下蛋白質提取物無需沉淀，直接在這種緩沖液中制備和分析。不用將額外的離子化合物加入到樣品中，下述緩沖液已含有充分的高離液活^性（chaotropicactivity)。

①標準二維凝膠電泳裂解緩沖液 (RabiUoucUl 卯 8):7mol/L 尿素、2mol/L 硫脲、4%CHAPS、2 mg/mLDTT 及 50 mmoVLpH8.0 的 Tris-HCU

②用于膜相關蛋白質時有所調整：7mol/L 尿素、2md/L 硫脲、2% 脒基磺基甜菜喊-14 及 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-HCl。緩沖液系統包含其他鹽和去污劑，尤其是十二烷基磺酸鈉，可更有效地提取蛋白質，但必須在進行等電聚焦前先沉淀。

③TNE:50 mmol/LpH7.6 的 Tris-HC1、150 mmol/LNaCl、2 mmol/LpH8.0 的 EDTA、2 mmol/LDTT 及 l^WNP-40。

④RIPA 緩沖液：50 mmol/LpH8.0 的 Tris-HCl、150 mmol/LNaCl，l%NP-40、0.5% 脫氧膽酸及 0.1%SDS。

(2) 迅速重懸細胞以抑制蛋白酶解活性是至關重要的。將提取物 15000 g 或 100000 g 離心 10 min，除去可干擾等電聚焦的不溶性蛋白質和磷脂。

(3) 某些情況下，超聲可斷裂核酸使其在隨后的凈化步驟中與磷脂一同被除去，從而提高樣品質量。核酸和磷脂這兩種非蛋白質類陰離子組分都會干擾等電聚焦 (詳見本章 3.2 節）。建議將樣品放置冰上，并使用超聲儀尖端探頭進行短脈沖處理。

(4) 在所有的步驟中，使體系保持冷環境是很重要的, 尤其是含有尿素的樣品絕不能被加熱。尿素過熱 (超過 37°C) 會加速異氰酸鹽 (一種尿素的自然分解產物）的形成，反過來將使自由氨基甲酰化。當該反應發生在蛋白質上時 (發生在氨基末端的殘基上或在賴氨酸殘基的 e-氨基上），會阻止這些位點的質子化，引起等電點的酸性漂移。二維凝膠電泳中大量樣品氨基甲酰化造成的結果是漂亮的蛋白質斑點串，看起來好像是翻譯后修飾，但卻完全是偽跡。

(5) 測量蛋白質濃度可采用各種標準方法。需注意要采用與蛋白質提取緩沖液相兼容的方法。例如，CHAPS 和硫脲（盡管完全適合于蛋白質提取）將會干擾 Bradford 或 BCA 實驗，導致數據錯誤和不可靠。遇到這些情況時，應該在定量前沉淀分裝出來的小份樣品，再重溶于適當的緩沖液中，或采用與定量實驗相兼容的去污劑。

(6) 對于細胞培養實驗，蛋白質濃度可由細胞數目估算得出。例如，對于由 697 前-B 淋巴瘤細胞株制備得到的蛋白質樣品（可從德國微生物菌種保藏中心獲得，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZNo:ACC12)，IO7 個細胞約對應 Img 蛋白質提取物。為了移除生長培養基組分 (尤其是血清蛋白質），在收集細胞前必須要徹底地清洗細胞 (至少用 PBS 清洗 2 次)。需用細的移液器 tip 頭將最終的細胞沉淀中所有的 PBS 小心吸去。細胞沉淀 (通常每管 IO8 個細胞) 保存在一 8 0°C。

(7) 細胞提取物此時可以用于脫水的梯度膠條，可以通過膠內再水化或是杯上樣完成。在加人樣品前，應該加人適當的兩性電解質或是 IPG 緩沖液，大多數只需 0.5%(V/V)(但如果需要的話增量到 2% 也可以接受）。如果樣品緩沖液中沒有溴酚藍，加入少量 (可加入干固體的少許晶粒, 或者幾微升溴酚藍水溶液) 以作為等電聚焦的失蹤染料，同時也作為杯上樣過程中的視覺輔助。或者，樣品可無期限地先保存在一 8 0°C。

樣品凈化與沉淀

正如前述，有時非蛋白質離子 (如鹽、磷脂) 的存在會降低 IPG 膠條的電阻, 干擾等電聚焦，因此在不使膠條過熱的情況下難以獲得需要的高電壓以進行高分辨率聚焦。由于大部分商品化的等電聚焦儀器都將許多膠條集合在并聯電路上，其中一個膠條出現電阻顯著性差異將會對其他膠條分離造成不利影響。

通常一 欠凈化或沉淀步驟可以移除這些干擾離子，或者至少使所有樣品標準化至具有相似電阻。沉淀不僅可以同時移除多種污染物，而且還能有效瓦解復合物和不可逆地抑制蛋白酶活性。最有效的沉淀方法是使用甲醇和三氯甲烷 [根據 Wessel 和 Flugge(1984)] 或使用三氯乙酸、脫氧膽酸鹽和丙酮 [根據 Arnold 和 UlbriCh-H o fmann(1999)]。

在等電聚焦前，蛋白質必須在增溶液中再溶解 (詳見本章 3.1 節）。此外，一些用于蛋白質二維凝膠分析的沉淀試劑盒也可從一些商業渠道獲得。Wessel 和 Flugge(1984) 方法的改編版描述如下。

(1) 將預定量的蛋白質提取物用水補足體積至 1 00 pL。

(2) 加人 3 0 0 水 (3 倍體積）。

(3) 加人 400 甲醇 (4 倍體積)。

(4) 加人 100fiL 氯仿 (1 倍體積)。

(5) 劇烈渦漩振蕩并離心。蛋白質沉淀物將出現在分界面上。

(6) 將水/甲醇混合物從分界面頂端去除，小心不要擾動分界面。沉淀的蛋白質通常不會形成一個可見的白色分界面，因此注意不要破壞分界面。

(7) 再次加人 400 甲醇以清洗沉淀。

(8) 劇烈渦漩振蕩并離心。蛋白質沉淀物便沉積于試管底部。

(9) 去除上層清液，并用真空離心機將蛋白質沉淀簡單地干燥。

(10) 在適量的可兼容二維凝膠的緩沖液中重懸這些蛋白質沉淀 (詳見本章 3.1 節）。

當用沉淀法作為凈化步驟時，建議蛋白質起始濃度為 1~1 0 mg/mL。如果蛋白質樣本過稀，在清除沉淀后將很難定量地回收蛋白質。凍/融也應控制在最少量，通常 ImL 分裝量或更少的冷凍樣本就已足夠。對于 DIGE 實驗而言，沉淀步驟極大地滿足了標記樣本在不含游離氨且酸堿平衡的二維凝膠電泳樣本緩沖液的需求。

使用酸性范圍的 IPG 肢進行等電聚焦

大多數商品化的等電聚焦儀器每次電泳時都能夠裝載至多 12 條獨立的 IPG 膠條。

重要的一點是，要將同一次電泳中待測的每根 IPG 膠條都盡可能保持同一水平，因為在大多數配置中，單個的 IPG 膠條會在正電極和負電極之間形成一個并聯電路。任何 IPG 膠條若在組分中 (特別是在離子成分方面) 異于其他膠條，便會影響到所有膠條的分辨率，有時這種消極影響是巨大的。因此，強烈建議只同時聚焦同一 PH 梯度的相同長度的 IPG 膠條，所用的樣品也要來源于同一實驗（如樣本類型和組分要盡可能相同)①。

以下方法用于 24 cm,pH4~7 的 IPG 膠條。

(1) 將 IPG 膠條在含有蛋白質總量高達 0.5~2 mg 的二維凝膠樣品緩沖液中再水化 (詳見本章 3.1 節），對于每根 24 cm 的膠條，需要在再溶脹托盤中將蛋白質樣品稀釋或重懸至終體積 450uL。用 2~3 mL 的石蠟油覆蓋膠條防止尿素結晶。

(2) 加人樣品的膠條的再水化過程至少要經過 12 h, 但更建議在室溫下進行一夜。一些蛋白質，特別是高分子質量蛋白質需要更長的時間才能在再水化過程中進入膠條內。

(3) 在完全再水化后, 將膠條移人水平電泳系統, 并將此系統的冷卻塊溫度恒定于 20°C。

(4) 將潮濕的吸干紙鋪于再水化的 IPG 膠條兩端，電極放置到位，并把石蠟油覆蓋在膠條之上&。

(5) 表 30.1 為典型的聚焦方案。

再水化上樣是二維凝膠電泳樣品導入的最簡便方法，這一方法使得樣品緩沖液中的蛋白質樣品在 IPG 膠條吸收樣品溶液時被動導入，且蛋白質可以在整個 pH 梯度中均勻分布。在一些商品化的等電聚焦儀器中，IPG 膠條的再水化和聚焦可以用相同設備儀器完成，無需人工操作。這種儀器也可以進行所謂的主動再水化，即在膠條再水化上樣過程中接入低電壓 (30~50V)，在一些情況下, 主動再水化可以促進樣品應用，因為這促使鹽離子向電極移動，去除了蛋白質中的蛋白酶，并幫助大分子進入凝膠之中。然而, 等電聚焦過程中的 IPG 膠條再水化方法 (正面朝下) 有些時候也會出現較低分辨率的情況，這是由于等電聚焦膠條的多余的機械應力加在了聚焦托盤和塑料凝膠襯底之間，蛋白質數量較多時這種情況尤為常見。在這些情況下，使用聚焦儀器，并讓塑料襯底直接與聚焦托盤接觸 (凝膠便會正面朝上），可利于更為復雜困難的樣品（圖 30.3)。

(6) 可選項：主動再水化 (在一些設備配置下可以進行）。當梯度膠條正面朝下并和電極接觸時，樣品的再水化即可發生。再水化過程中，電極會在膠條上產生較低（通常 30~50V) 電場。在一些情況下，主動再水化能夠促使高分子質量蛋白質進人梯度膠條之中。在這種配置下，等電聚焦儀器一開始聚焦于正面朝下的梯度膠條之上，而這時并不需要人工干預。

使用堿性范圍的 IPG 肢進行等電聚焦

再水化上樣的一大優點便是省去了許多人工操作步驟。然而，它也有許多不足之處, 特別是在堿性 pH 范圍中，因為在堿性環境中蛋白質會在膠條表面聚集, 并在二維凝膠中留下水平拖尾。

與酸性范圍相比 JPG 膠條在堿性范圍的電泳條件有所不同。在堿性 pH 環境下的等電聚焦過程，存在著還原劑 DTT 的水轉運與遷移。為了將這些影響降到最低, 蛋白質樣品通常在陽極一端進行杯上樣, 而不是進行凝膠內再水化（圖 30.3)。堿性膠的最大蛋白