正常細胞和腫瘤細胞都能將5-FU 代謝為5-氟-2-脫氧尿苷酸單磷酸（FdUMP）和5-氟尿苷三磷酸（FUTP）。這些代謝產物通過二種不同機制引起細胞損傷。首先，FdUMP 及葉酸協同因子N5，10-亞甲基四氫葉酸與胸苷酸合成酶（TS）結合形成共價結合的三重復合物。這種結合抑制2'-脫氧尿[嘧啶核]苷酸形成胸核苷酸。胸核苷酸是胸腺嘧啶核苷三磷酸必需的前體，而后者是DNA合成所必需的，因此該化合物的不足能抑制細胞分裂。其次，在RNA 合成過程中核轉錄酶可能會在尿苷三磷酸（UTP）的部位錯誤地編入FUTP。這種代謝錯誤將會干擾RNA 的加工處理和蛋白質的合成。
