NRTI均為DNA的天然底物的衍生物,其中AZT和d4T為脫氧胸苷的類似物；ddC和3TC為脫氧胞苷的類似物；ddI和TNF為脫氧腺苷的類似物；ABC為脫氧鳥苷的類似物,均需在細胞內轉化為活性的三磷酸衍生物,通過胸苷激酶、胸苷酸激酶的磷酸化作用,形成活化型三磷酸體(AZTTP)。AZTTP為HIV-RT底物競爭性抑制劑,抑制病毒RT的活性；脫氧胸苷三磷酸代替病毒的DNA,使病毒DNA鏈中止增長從而阻礙病毒繁殖。此外,由于NRTI在結構上3′缺乏羥基,當結合于到前病毒DNA鏈的3′末端時,不能再進行5′—3′磷酸二酯鍵的結合,終止病毒DNA鏈的延長和復制 。