（1）雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短，會使僅僅富含A+T區域變性。當模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。
（2）復性過程采用的溫度至關重要如果復性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復性，擴增效率將會降低。如果復性溫度太低，引物將產生非特異性復性，從而導致非特異性的DNA片段的擴增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進行。
（3）PCR擴增所需的循環數目決定于反應體系中起始的模板拷貝數以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進入幾何級數的增長期，反應會一直持續下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說，擴增產物中絕大多數應該是特異性的擴增產物，而非特異性的擴增產物應該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應體系中進行30個循環后往往可以做到上述的理想情況。