生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸,每組寡核苷酸都有固定的起點,但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。
由于DNA上的每一個堿基出現在可變終止端的機會均等,因此上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物,這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。
在可以區分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下,對各組寡核苷酸進行電泳分析,只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道上,即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。