嘔吐毒素的介紹
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又稱為嘔吐毒素，屬單端孢霉烯族化合物。該毒素是F.鐮刀菌霉（主要是 F.graminearum h 和 F.culmorum）的二級代謝產物，化學名為3α，3β，7α，15-四羥基鑣草鐮刀菌-9-烯-8-酮。這類真菌大多在低溫、潮濕和收割季節，在谷物莊稼中慢慢生長。嘔吐毒素一般在大麥、小麥、玉米、燕麥中含有較高的濃度，在黑麥、高粱、大米中的濃度較低。下表列出了世界各地各種商品嘔吐毒素的存在情況。
嘔吐毒素在世界各地各種商品嘔吐毒素的存在情況
商品 | 國家 | 文獻發表年份 | 被分析樣品數 | 出現率/% | 含量范圍/(μg/kg) |
小麥 | 加拿大 | 1998 | 117 | 100 | 30~15790 |
玉米粉 | 英國 | 1998 | 40 | 98 | 50~5000 |
小麥 | 阿根廷 | 1997 | 40 | 80 | 300~4500 |
小麥 | 阿根廷 | 1997 | 60 | 93 | 100~9250 |
小麥 | 德國 | 1997 | 445 | 91 | 3~20538 |
大麥 | 德國 | 1997 | 240 | 81 | 2~4764 |
小麥 | 加拿大 | 1997 | 2311 | 33 | 10~10500 |
小麥制品 | 加拿大 | 1997 | 1257 | 43 | 10~4060 |
玉米 | 加拿大 | 1997 | 283 | 86 | 20~4090 |
DON 常常與其他真菌毒素同存，從谷物和飼料中分離出來的 DON 的最高濃度已達92mg/kg。業已證明，發霉玉米中的 DON 對豬會產生毒性，對人產生食物中毒性白細胞缺乏癥。動物飼料中嘔吐毒素的中毒癥狀表現為：厭食、嘔吐、消化道發炎、白血球下降、白尿、運動失調、內臟出血、中樞神經系統細胞變質，具有較強的細胞毒性，對血液及皮膚組織具有損害作用，細胞生長上表現出抑制蛋白質合成和 DNA 合成的作用。目前一些國家已制定了谷物中 DON 的限量標準，加拿大規定供人食用小麥中 DON 的限量標準為 2mg/kg，嬰兒食品為 1mg/kg，美國還未建立衛生標準，但在 1982 年建議當供人食用小麥制品中 DON 含量為 2mg/kg 時應引起關注，我國也建議供人食用的谷物中 DON含量不得超過 1mg/kg。谷物中 DON 的快速測定方法有免疫親和柱-熒光計快速分析法和酶聯免疫吸附測定法。
在單端孢霉烯族化合物中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇由于在分子結構上存在著三個羥基，為復合抗原（毒素與載體蛋白的結合物）的制備帶來了一定的困難。1988年，Casale 等人用丁基硼酸將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子結構中7和15位上的兩個羥基先期封閉起來，通過3位上的羥基轉變成琥珀酸酐衍生物，繼而實現與載體蛋白的結合。運用該方法，衛生部食品衛生監督檢驗所制備出抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單克隆抗體，并建立了小麥中測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的間接酶聯免疫吸附測定法。
（1）試劑
①化學藥品：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，四甲基聯苯胺，甲醇，石油醚，三氯甲烷，無水乙醇，乙酸乙酯，二甲基甲酰胺，吐溫-20，30％過氧化氫等。
②緩沖液系統
包被緩沖液 50mmol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，PH9.6。
洗液：含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，PH7.4。
樣品與標準毒素稀釋液：含20％甲醇的洗液。
底物緩沖液：0.1mol/L 的磷酸-檸檬酸緩沖液，PH5.0。
底物溶液：取 50μL 四甲基聯苯胺溶液，加10mL底物緩沖液、10μL 130％過氧化氫，混勻。
終止液：為 1mol/L 硫酸溶液。
③脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液：用甲醇配成 1mg/mL 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇貯備液-20℃冰箱貯存。于檢測當天，精密吸取貯備液，用稀釋液稀釋成制備標準曲線的所需濃度。
④包被抗原：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與載體蛋白牛血清白蛋白的結合物。
⑤抗體：抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的特異性單克隆抗體。
⑥酶標二抗：兔抗鼠免疫球蛋白與辣根過氧化酶的結合物。
（2）分析操作步驟
①提取與凈化 稱取20g 粉碎并通過20目篩的樣品，置200mL 具塞三角燒瓶中，加 8mL 水和 100mL 三氯甲烷-無水乙醇（4:1），密塞，振蕩1h，通過濾紙過濾，取 25mL 濾液于蒸發皿中，置90℃水浴上揮干。用 50mL 石油醚分次溶解蒸發皿中殘渣，洗入250mL 分液漏斗中，再用 20mL 甲醇-水（4:1）分次洗滌，轉入同一分液漏斗中，振搖1.5min，靜置約 15min，收下層甲醇水提取液過層析柱凈化（層析柱的裝備：在層析柱下端與小管相連接處塞約 0.1g 脫脂棉，盡量塞緊，先裝入0.5g中性氧化鋁，敲平表面，再加入 0.4g活性炭，敲緊。將過柱后的洗脫液倒入蒸發皿中，并于水浴鍋上濃縮至干，趁熱加 3mL 乙酸乙酯，加熱至沸，揮干，再重復一次，最后加 3mL 乙酸乙酯，冷至室溫后轉入濃縮瓶中。用適量乙酸乙酯洗滌蒸發皿，并入濃縮瓶中。將濃縮瓶置95℃水浴鍋上，揮干冷卻后，用 0.5mL 的稀釋液定容，供本法檢測之用。
②酶聯免疫吸附測定 用包被抗原（20μg/mL）包被酶標板，每孔100μL，4℃過夜；酶標板用洗液洗3次，每次3min 后，加入不同濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液（制作標準曲線）或樣品提取液（檢測樣品中的毒素含量）與抗體溶液（1:2000）的混合液（1:1，每孔100μL，該混合液應于使用的前一天配好，4℃過夜備用），置37℃，1h；酶標板洗3次，每次 3min 后，加入酶標二抗，每孔 100μL，置37℃，1.5h；同上述洗滌后，加入底物溶液，每孔100μL，37℃，30min；用終止液終止反應，每孔50μL，于波長450nm 處測定OD值。
③結果判定 樣品檢測孔所測得的 OD 值大于（或等于）陽性對照孔 OD 值，該樣品為陰性，反之，則為陽性。陽性樣品的毒素含量可根據下式計算。
毒素含量：
式中C—酶標板上所測得的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的量，ng，根據標準曲線求得；
V1—樣品提取液的體積，mL；
V2——滴加樣液的體積：mL；
D——樣液的總稀釋倍數；
M—樣品質量，g