粘粒及質粒文庫的鋪平板和轉移實驗——基本方案

質粒

LBNaOH氯霉素Tris·ClNaCl

硝酸纖維素濾膜離心機布氏漏斗培養箱

1.  在含抗生素的平板上，通過系列等比稀釋確定質粒和粘粒文庫的滴度，計算出最佳的鋪平板用的細菌懸液量并稀釋到5~10 ml LB培奍基中。

2.  準備一層無菌的10 cm 或15 cm的Whatman 3 MM 濾紙，故在玻璃布氏漏斗或瓷質過濾漏斗中，加入10~20 ml LB培養基。

3.  將標記好方向的硝酸纖維素濾膜放入含抗生素的LB平板中，并移至過濾裝置，再將細菌懸液用吸管加到濾膜上，注意不要往濾膜邊緣4~5 mm 處加液體。

4.  慢慢抽吸液體，待菌懸液被吸干之后，揭下濾膜并移至含抗生素的平板中，置于37℃培養，直至長出直徑達1~2 mm 的菌落。

5.  標記并浸濕另一張硝酸纖維素濾膜。

6.  先將長有克隆的濾膜（細菌面朝上）放在幾張20 cm×20 cm Whatman 3MM 濾紙上。

7.  戴上手套把浸濕的硝酸纖維素濾膜按標記好的位置覆蓋到長有細菌的膜上，膜于膜之間最好錯開2~3 mm，以便于濾膜之間的分離。

8.  在硝酸纖維素膜上覆蓋3張20 cm×20 cm 的3 MM 濾紙，并同樣大小的玻璃平板壓在其上，轉印克隆。

9.  移去壓在濾膜上的玻璃平板和濾紙，用20-G針頭在重疊的原濾膜和轉印膜上刺一小孔以標記方向。

10.  然后將它們分開，有菌落的一面朝上分別放入瓊脂平板中過夜生長，轉印膜 于37℃培養，原濾膜則于25℃培養。

11.  主瓊脂平板保存于4 ℃，或繼續進行轉印實驗。

12.  將濾膜轉栘到含50 μg/ml 氯霉素的LB平板上，37s℃培養4~10 h，以擴增粘粒和質粒。

13.  接著，濾膜轉印面朝上，依次放在3張分別飽蘸下面3種液體的46 cm×75 cm 3MM Whatman濾紙上5 min。

（1）0.5 mol/l NaOH

（2）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5

（3）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5 / 1.25 mol/l NaCl

14.  用3 MM 濾紙將濾膜吸干后于80℃真空烤爐干烤90 min。

15.  采用切口平移標記的探針與濾膜作雜交實驗。