第二節 大便隱血實驗的進展
隱血實驗是指檢查胃腸道隱性出血的一類實驗方法。對胃癌和大腸癌等消化道腫瘤，持續的消化道出血可能是其早期出現的唯一特征，且大便隱血檢查屬無創檢查，試驗方便、費用低廉，適合進行長期觀察，因而大便隱血試驗則目前仍舊是早期發現的較好試驗。
傳統的隱血實驗是利用血液中RBC的血紅蛋白的亞鐵血紅素具有類過氧化物酶作用，能分解H2O2為水和活性氧而設計的簡易化學試驗試驗。這類方法雖然成本低廉、簡單易行，但特異性差、靈敏度較低，易受食物及服用藥物成分的影響。為解決傳統隱血試驗的特異性問題，人們探索了一些新的隱血試驗方法，如同位素鉻（51Cr）法等同位素法和各種免疫學方法。
一、同位素方法
（一）鉻（51Cr）法測定大便隱血量
1．原理
51Cr-紅細胞經靜脈注射后,正常不進入消化道,消化道出血時則進入并不被吸收,隨大便排出。將大便中的放射性與每毫升血液中放射性比較計算可求出胃腸道出血量。
2．方法
靜脈注射51Cr-RBC 7.4MBq后,收集72小時大便,稱重測放射性,并在開始時和收集大便結束時抽靜脈血測每毫升放射性計數。按公式計算結果。
72H出血量(ml)=大便總放射性/每毫升血放射性
（二）胃腸道出血的锝標的紅細胞法定位診斷
1．原理
當胃腸道出血時,锝標的紅細胞或膠體隨血液進入胃腸道。
2．方法
靜脈注射顯像劑后以2-5分鐘一幀的速度連續顯像0.5-1小時,必要時延遲顯像。但膠體不能進行延遲顯像。
3．臨床應用
適應于活動胃腸道出血的診斷和大致定位。急性活動出血用锝標膠體顯像,間歇出血者用锝標RBC顯像。診斷準確率在80%左右,能夠探測出血率高于每分鐘0.1ml的消化道出血。
盡管同位素方法的靈敏度和特異性無可非議，甚至還可以對出血點進行準確的定位，但臨床很難接受將一種應用放射性同位素的、操作復雜的、需要特殊儀器的方法普遍用來進行一個沒有特異性的指標的檢驗。
二、免疫學方法
免疫學方法以其特異性和靈敏度而廣受臨床檢驗的歡迎。基于免疫反應的隱血實驗方法是當前發展最快也最有臨床實用價值的隱血實驗方法。應用免疫學方法的隱血實驗具有很好的靈敏度，一般血紅蛋白為0.2mg/L或0.03mg/g糞便就可得到陽性結果，且有很高的特異性，各種動物血血紅蛋白在500mg/L、辣根過氧化物酶在2000mg/L時不會出現干擾，因而不需控制飲食。
根據文獻報道，有三類抗體可用于糞便的隱血實驗：一種為抗人血紅蛋白抗體，一種抗人紅細胞基質抗體，另一種為抗血液中其他成分如α1-AT、Tf、Hb-Hp等。采用抗α1-AT、Tf、Hb-Hp等抗體的隱血實驗對所有消化道出血均呈陽性反應；而抗人血紅蛋白法和抗人紅細胞基質法隱血試驗主要檢測下消化道出血，約有40-50%的上消化道出血不能檢出，原因是：
①血紅蛋白或紅細胞經過消化酶降解就業性或消化殆盡已不具有原來免疫原性；
②過量大出血而致反應體系中抗原過剩出現前帶現象；
③病人血紅蛋白的抗原與單克隆抗體不配。
因此，抗人血紅蛋白法或抗人紅細胞基質的隱血試驗目前被認為是對大腸癌普查最適用的試驗。為了使免疫學方法在檢測糞便潛血時盡可能簡便，以適應大規模大腸癌普查的需要和臨床快速報告的要求，有的公司已經推出單克隆抗體一步法試驗，如美國萬華普曼生物工程有限公司。他們所采用的糞便潛血免疫一步法是一種快速簡便，無嗅無味的三明治夾心免疫檢驗法。具有特異性強、高靈每度（0.03mgHb/g糞）、檢驗快速（1
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5分鐘）、便操作簡單（一步檢驗）、試劑易保存（室溫）和結果簡單易讀的優點，在診斷和治療引起腸胃道出血的疾病有重要意義。特別是消化道癌腫患者87%便隱血為陽性。但是，據Herzog和Cameron等研究，正常人24小時胃腸道生理性失血量為0.6ml，由于免疫學方法的高度敏感性，在某些正常人特別是服用刺激備用腸道藥物后或處于應急反應狀態時也可能造成假陽性。
三、其它方法
近年來某些實驗室還采用卟啉熒光法血紅蛋白定量試驗，用縶草酸試劑使血紅素變為卟啉進行熒光檢測，這樣除可測糞澡未降解的血紅蛋白外，還可測血紅素衍化物卟啉，從而克服了化學法和免疫法受血紅蛋白降解影響缺點，可對上、下消化道出血同樣敏感，但外源性血紅素、卟啉類物質具有干擾性，且方法較復雜，故不易推廣使用。
第三節 糞便基因檢驗的研究進展
近年來，大腸癌發病率有上升趨勢，全世界每年新增病例高達57萬，占全部確診癌癥的4%[1]。大腸癌的癥狀體征均無特異性，致使臨床上確診的大腸癌大部分為中、晚期，臨床治療效果差，5年生存率極低。如能早期診斷出大腸癌，可使90%以上的患者得到治愈。因此，大腸癌的篩選診斷工作非常重要。既往應用最普遍的篩選檢查是大便潛血實驗（FOBT），雖然FOBT在篩選大腸癌方面取得一些進展，但有很高的假陽性率和假陰性率。纖維結腸鏡檢查是檢出大腸癌的可靠方法，但該方法為侵入性且需要一定的設備和儀器，操作要求也較高，目前尚不能用于大范圍人群篩選普查。腫瘤標記物檢查，如癌胚抗原（CEA）、CA19-9及腫瘤相關抗原T、Tn及TAG-T2等，雖然對大腸癌的臨床診斷及預后判斷有幫助，但對早期大腸癌診斷的特異性及敏感性均不高。隨著分子生物學的發展，人們認識到腫瘤的發生發展歸因于相關基因突變，而糞便中的脫落細胞包含著與大腸癌關系密切的突變基因，糞便中基因檢測可望成為篩選診斷大腸癌的新方法。
一、糞便基因篩檢的分子生物學基礎
分子生物學研究表明，腫瘤的產生是多能干細胞向正常細胞增殖、分化的過程中，受環境因素和遺傳因素的影響，相關基因發生改變的結果。腫瘤細胞的基因與基因表達與正常細胞有顯著區別，因此如能檢出這種基因改變就能為腫瘤的診斷和預防提供條件。腫瘤不是單基因疾病，腫瘤的發生發展是腫瘤相關基因的多階段積累的改變過程，涉及到多種癌基因激活和多種抑癌基因失活。如能在早期檢出基因突變信息，就可以獲得細胞癌變的信號，從而對腫瘤的早期診斷和預防帶來積極意義。
目前認為一種腫瘤的產生需要4～5個相關癌基因的改變；與大腸癌相關的癌基因主要有ras、c-myc、-erb2等，與大腸癌相關的抑癌基因主要有APC/MCC、DCC、p53及RB等。在大腸癌形成過程中，ras、c-myc癌基因和APC、MCC抑癌基因的改變是早期事件。Ras基因改變主要發生在12、13或16密碼子，大約50%的大腸癌和50%的大腸腺癌（直徑>1cm）發現有ras基因突變。等位基因的丟失最常見于17p染色體等位基因的缺失。雖然這種缺失在大腸腺瘤的各個時期都很少見到，但有人發現17p等位基因丟失與腺瘤向癌轉變有關。17p染色體等位基因丟失的常見部位為p53基因，K-ras、p53基因是人類癌癥最常見的突變基因，兩者的檢出對大腸癌的診斷很有幫助。包含APC基因和MCC基因的5q等位基因的缺失占散發性大腸癌的35%。這些基因的特異性改變可成為診斷腫瘤的標記。
人們很早就發現，結腸粘膜上皮不斷脫落入腸腔隨糞便排出，其更新周期約為每小時1%，整個大腸粘膜約3～4天即可重新更換一次，而生長旺盛的腫瘤組織更新更快。雖然這些粘膜細胞脫落后很快從糞便中排出，但由于糞便物質的存在，用脫落細胞學手段難以發現異常細胞。要進行細胞學分析，只有從直腸、結腸的灌洗液中才能得到比較干凈的細胞，這無疑又增加了方法的難度和病人的痛苦。然而，應用分子生物學技術檢測糞便中的相關基因突變，則不受糞便其他物質的影響，且可以批量篩查，可望稱為大腸癌的篩選和早期診斷的一種敏感而有效的方法。
二、糞便基因突變檢測方法
Sidransky于1992年首次闡述可以從大腸癌糞便脫落細胞檢出K-ras基因突變，但他所采用的方法比較復雜，因而不能用于常規例行診斷。目前檢測糞便基因突變的方法主要有：（1）免疫組織化學檢測（IHC）；（2）Southern印跡雜交；（3）DNA直接測序；（4）PCR產物單鏈DNA泳動變位技術和錯配PCR技術。傳統的Southern印跡雜交和DNA直接測序，雖然可準確地確定突變的類型及部位，但操作復雜、技術要求高、時間長、費用較高，不實用于臨床篩檢基因突變。目前多采用的是免疫組織化學法檢測癌相關基因產物，如檢測p53蛋白、ras基因的p21蛋白及c-mye的p62蛋白。雖然該技術簡單，但有相當一部分基因改變檢測不到，且運用不同的抗體需要不同的解釋標準，臨床意義也不同。Soong等用IHC檢測p53蛋白和用PCR-SSCP檢測p53基因突變發現，IHC對大腸癌的p53蛋白檢測率為23%，而PCR-SSCP分析技術檢出p53基因突變率為39%，兩者的符合率為68%，不符合率為32%，說明p53蛋白積累不能代表有p53基因突變，反之亦然。Hall等也認為p53蛋白免疫組化陽性并不一定是突變的p53積累，還可能是穩定的野生型p53蛋白在起作用。因為當正常細胞的DNA受損害時，野生型p53蛋白也會過量表達。在其他種類的癌組織中也發現p53蛋白增加并沒有相應的p53基因突變。
PCR及其相關技術的迅速發展也為快速、簡便、靈敏地篩選突變基因帶來了可能。其中PCR產物的單鏈DNA泳動變位技術（mobilityshifts）在診斷基因突變方面有滿意的敏感性（90%～100%）并能篩選大量樣本。該技術包括變性梯度凝膠電泳（DCGE）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、限制性片段多態性分析（RFCP）、單鏈構象多態性分析（SSCP），其中，DGGE和TGGE法價格昂貴，其臨床應用受限制。
目前，PCR-SSCP是最受重視的分析技術，該技術利用相同長度的單鏈 DNA在非變性的凝膠電泳中不同遷移位置僅取決于單鏈二級空間構象——堿基排列結構，從而將突變基因片斷與正常基因片斷區分開來。其優點為：（1）操作簡單，不需要特殊儀器，技術容易掌握；（2）實驗周期短，最快可在24小時內得到檢測結果，并不受PCR擴增差錯的影響；（3）不僅可檢查出單堿基置換，還可檢出數個堿基插入或缺失；（4）可彩非放射性同位素標記，使其更容易在臨床上推廣使用。日本學者Equchi于1996年開始對糞便標本中的p53基因進行PCR-SSCP分析，結果發現在11例有p53基因突變的手術標本中有7例在糞便中查出p53基因突變；在5例潛血試驗阻性的病人中有3例糞便標本檢出p53基因突變，故認為利用PCR-SSCP對糞便腫瘤物異的基因突變進行分析可在臨床推廣應用。但該技術易產生假阻性，為其不足之處。這可能是由于在擴增的片斷中，大部分為正常的基因片段，突變的基因片段較少，因此在電泳泳動變位上顯示不佳。為了確定PCR-SSCP
檢測的敏感性，Silvano等將腫瘤細胞混以正常細胞，濃度依次由0%-90%遞增，然后進行PCR-SSCP分析，結果發現當彩放射性標記時腫瘤細胞濃度須達5%，PCR-SSCP分析才能檢出p53基因突變，而當用非放射性標記時腫瘤細胞濃度必須達到10%-15%才能顯示出陽性結果。
在大腸癌患者糞便中，特別是早期癌患者的糞便中，正常的DNA片斷常超出異常DNA片段100-1000倍，使用SSCP分析時腫瘤相關基因的泳動變位不清楚。
近來年常有人彩特異等位基因PCR擴增（ASA）可以解決這一難題。其主要原理是當異性引物與模板之間出現錯配（mismatch），特別是3’末端堿基與模板之間出現錯配時，由于Tag
DNA聚合酶缺乏3’-5’核酸外切酶活性，因此對錯誤配對的堿基不能進行修改，故該引物的PCR擴增速率將急劇下降甚至擴增中斷。有人設計出一個能與突變體基因片段正常配對而與正常片斷錯誤配對的引物，主要是在3’末端的堿基進行修改。該方法的優點是敏感性、特異性很高，可以從10000個正常和不正常細胞中檢出一個突變細胞。此外，該技術不需要限制性酶消化及與特異性等位基因相結合的寡核苷酸，也不需要對PCR產物進行測序分析。由該原理還可產生其他方法，如misnatched
PCR \ARMS(amplificatation refraitory mulation system)、mutent enriched
PCR。該技術對單基因疾病如遺傳病效果好，但腫瘤涉及到多基因改變，并且每個基因有多種突出，例如p53突變種類達350種，因此目前該技術主要應用于對K-ms基因突變的檢測。因為K-ms基因的突變幾乎總是發生于三個密碼中的一個，所以設計檢出K-ms基因的敏感試驗要設計檢出其他腫瘤相關基因改變要簡單得多。德國學者Nollaan于1996年彩突變體富集PCR技術檢測糞便中K-ms基因的12、13密碼子的基因改變，16例大腸癌手術標本經用PCR-SSCP分析后證實無K-ms突變的病人糞便中，經突變體富集PCR技術檢測有2例K-ms突變，通過對手術標本再次作PCR-SSCP分析檢測發現，確有1例手術標本中有K-ms突變。該作者認為該技術具有簡便、靈敏性、特異性高等優點，臨床上可用于檢測糞便中的K-ms突變，有助于大腸癌的早期診斷。
除在糞便中檢出基因突變以期早期診斷大腸癌外，人們還開始在尿液、胰液、痰液、支氣管腫泡灌洗液、CSF等排泄物、分泌物中查找相關基因突變，以便能早期診斷相關部位癌癥。相信隨著技術的改進，應用分子生物學技術檢測腫瘤特異性基因將成為診斷腫瘤的重要方法。
第四節 糞便檢驗的新思路
免疫學、分子生物學等新技術的引入給糞便檢驗帶來了嶄新的檢驗手段，這使得臨床糞便檢驗技術得到了快速的發展。但是，無論是免疫學方法還是分子生物學技術，都是具有很強的檢驗目的針對性的方法，難以通過一次或幾次實驗就解讀出病人糞便中所包含的消化功能、新陳代謝、菌群紊亂以及腫瘤等豐富的生理、病理信息。換言之，這些方法在為大便檢驗帶來高特異性的同時，也丟棄了大量的、可能極有價值的信息。有沒有特異而又具有高通量的方法呢？
一、基因芯片技術
基因芯片的概念來自于計算機芯片，其實質是在面積不大的基質表面有序地排列了大量可尋址的識別分子。具體地說，就是在玻璃、硅等載體上有序地、高密度地（點與點之間的距離一般小于500）排列、固定了大量的靶基因片段（也叫探針分子）。這些被固定的探針分子在基質上就形成了高密度DNA微陣列。因此，基因芯片（Gene
Chip）也叫基因微矩陣（Gene Microarray）。
由上面的基因芯片的定義可以看出，基因芯片技術實質上是一種高度集成的基因探針雜交技術。它既承襲了DNA探針雜交技術的高特異性，又具備了同時檢測多靶基因的實驗高通量的特點。
雖然基因芯片具有另人鼓舞的優越性，但由于它還是一種嶄新的實驗技術，目前還沒有來得及應用到大便檢驗上來。就目前的技術來看，設計一張集成有消化道腫瘤基因識別譜、消化道病毒基因識別譜、消化道常見致病菌基因識別譜、消化道寄生蟲基因識別譜的“大便檢驗基因芯片”并沒有技術上的困難，只是目前基因芯片的成本太高，實驗方法也略顯煩瑣。但隨著大規模應用后成本的降低和實驗方法的進一步改進，出現可應用于臨床的“大便檢驗基因芯片”是遲早的事。當然，我們不能消極等待，我在此提及基因芯片技術，就是希望各位能在這方面作些工作，加快臨床糞便檢驗技術進步的步伐。
二、色、質譜分析
基因芯片等新興技術雖然給腫瘤、病原體等有生命的病原帶來了檢驗手段的突破，但是，對于胃腸道功能、胰腺功能等消化功能的檢驗就無能為力了。所以，我們在積極采用新技術的同時，也不要忘記成熟技術的新應用。
色譜法是一種經典的分離技術，它利用因混合物各組分在性質與結構上的差異而在流動相攜帶混合物流經固定相時，混合物中各組分與固定相相互作用的強弱而實現混合物各組分的分離。根據流動相的不同，色譜法又建立氣象色譜和液相色譜。質譜法是利用混合物中各組分的質量與所帶電荷的比值不同而實現組分分離的分離技術。目前，利用色譜法和質譜法建立的分析方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、質譜法、色譜-質譜聯用技術等。
雖然目前還沒有利用色譜法和質譜法大量讀取糞便醫用信息的報道，但國內的許多學者已經開始了利用色譜法和質譜法進行糞便藥代動力學研究、糞便毒物代謝研究甚至疾病的診斷探索。
內蒙古醫學院的王美玲等報道了利用色譜法研究遲發性皮膚卟啉病(porphyria
cutanea
tarda略稱PCT)患者卟啉的代謝情況。他們利用反相高效液相色譜法對PCT患者的尿液和糞便進行測定。結果發現PCT患者尿中有大量的尿卟啉和七羧基卟啉排出,糞便中糞卟啉明顯增多,并有異糞卟啉排出，用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對14例遲發性皮膚卟啉病(PCT)、15例急性間歇性卟啉病(AIP)、9例杜賓-約翰遜綜合癥
(DJS)和35例正常健康者的尿液和糞便中的糞卟啉異構體Ⅰ和Ⅲ進行定量分析。結果發現AIP、DJS和PCT患者的尿液和糞便中糞卟啉異構體Ⅰ和Ⅲ與正常健康者相比均發生不同程度的變化。說明可以利用七羧基卟啉和異糞卟啉的檢出值,診斷遲發性皮膚卟啉病。
北京大學的李衛杰等利用同時蒸餾萃取裝置(SDE)對羊糞中的揮發性成分進行提取,用氣相色譜-質譜聯用技術和氣相色譜程序升溫保留指數進行定性分析。質譜法共鑒定出45種組份,占峰面積的57.41%。用標樣和雙柱保留指數法進一步確證了其中的28種組分,占峰面積的27.86%。比較了鴿子糞和羊糞的相同揮發成分。華西醫科大學的雷蕾等報道從17只健康大熊貓糞便中分離出47株待檢菌,通過對其菌體形態和染色性,
菌落形態,生化反應,發酵最終產物的氣相色譜測定鑒定篩先出13株乳桿菌。這給我們以啟示：可以利用糞便的色譜分析來了解消化道菌群情況。
由于歷史的原因，我們的檢驗技術較某些先進國家存在很大的差距。各位檢驗研究生班學員擔負有振興我國檢驗事業的歷史重任。有人曾經說過，我們如果老是向別人學習，就只能永遠追著別人走，只有創新，才能成為科技的領跑者。希望諸位在學習的同時，積極發揮聰明才智，共同創造出我國檢驗技術的輝煌。