引言
數據非依賴采集（Data-Independent Acquisition, DIA）是當前最熱門的質譜采集技術之一，它以非目標的方式將質量范圍分為若干窗口，依次并循環采集窗口內所有母離子的二級碎片[1,2]。DIA 與 SRM 類似，也是基于子離子（transition）定量，相比傳統蛋白質組學定量方法具有更好的選擇性和更高的準確度。然而，目前DIA在翻譯后修飾分析上仍有較大瓶頸。DIA 依賴于 DDA 建立譜圖庫，而 DDA 數據在搜庫鑒定時，修飾位點定位錯誤的概率較高，特別是磷酸化修飾發生在常見的 S/T/Y 上，若肽段含有 2 個或以上位置接近的 S/T/Y，位點就容易找錯。將含有錯誤位點信息的鑒定結果作為譜圖庫，就會導致翻譯后修飾 DIA 解析結果的不可靠[3]。因此，DIA 尚難用于大規模的翻譯后修飾樣本分析。
針對修飾位點的打分算法使修飾位點的定位更加準確，Proteome Discoverer 軟件中整合的 phosphoRS/ptmRS 模塊[4]和 MaxQuant 軟件的算法[5]都可以實現位點可信度（Site Probability）的計算，從而獲得可靠的位點定位信息。本文基于上述軟件對翻譯后修飾 DDA 數據進行位點可信度分析，篩選具有準確位點定位的譜圖建立譜圖庫，導入 Skyline 軟件，進而實現可靠的翻譯后修飾 DIA 解析。將該流程應用于磷酸化樣本 DIA 數據分析，成功提取 6401 條高可信度的磷酸化肽段（Q < 0.01），占譜圖庫肽段總數的 98.4%，其中可用于準確定量的肽段（CV < 20%）占 86.9%，有效解決了翻譯后修飾 DIA 定量的難題。
實驗條件
實驗材料和方法
來源于大鼠組織富集的磷酸化樣本，最終上樣量為 700 ng/run，分別進行 DDA 和 DIA 采集，每種采集模式重復 3 遍。
色譜條件
納流高效液相色譜儀：EASY-nLC 1000（Thermo Scientific）
分析柱：納流 C18 色譜柱（長15cm, ID 75 μm, 粒徑3 μm）
流動相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度：0–3 min, 3–7% B; 3–95 min, 7–22% B; 95–113 min, 22–35% B; 113–116 min, 35-90% B; 116-120 min, 90% B
流速：300 nL/min
質譜條件
質譜儀：Orbitrap Fusion（Thermo Scientific）；
離子源：NanoFlex；離子模式：正離子；噴霧電壓：1.8 kV；毛細管溫度：275°C；S-Lens RF：60%
DDA：分辨率：一級120,000@m/z 200，二級30,000@m/z 200；AGC：一級2e5，二級5e4；二級Maximum Injection Time：100 ms；碰撞能量：HCD 30%
DIA：質量范圍：m/z 400–1200；窗口：25 m/z（窗口間 1 m/z 重疊，實際 Isolation window 設 26 m/z）；二級分辨率：30,000@m/z 200；二級AGC：1e5；二級 Maximum Injection Time：85 ms；碰撞能量：HCD 30%；每個 DIA 循環之間插入一次一級掃描。
數據處理
基于 Proteome Discoverer 2.0 軟件進行 DDA 鑒定、位點篩選和譜圖庫建立，Proteome Discoverer 1.4 和 MaxQuant 也可以實現相同的工作。
搜庫鑒定參數：Uniprot 大鼠蛋白數據庫，母離子質量偏差：10 ppm；碎片離子質量偏差：0.02 Da；固定修飾：C 烷基化（+57.021 Da）；動態修飾：M 氧化（M+15.995 Da）；S/T/Y 磷酸化（S/T/Y+79.966 Da）；酶：trypsin；Q 值（Percolator）：< 0.01；ptmRS 模塊：PhosphoRS mode: True; Use diagnostic ions: True
位點篩選和譜圖庫建立：對 PSM 表格“Isoform Confidence Probability”一項進行篩選，保留 _ 0.75 的結果，導成 PepXML 格式，并將相應譜圖導成 mzML 格式。PepXML 文件和 mzML 文件同時導入 skyline 建立高可信磷酸化肽段譜圖庫。
DIA 數據 Skyline 解析：根據 DIA 采集參數設置隔離窗口，將譜圖庫中所有肽段及相應蛋白作為 Targets，每個肽段選取強度最高的 6 個 b/y 離子進行峰抽提，提峰結果使用 mProphet 進行假陽性評估，控制 Q 值 < 0.01。
實驗結果
1. 精確修飾位點譜圖庫建立與 DIA 解析流程
由于肽段中含有多個可能發生翻譯后修飾的位點，如果不對可能發生修飾的位點進行可信度打分，會造成翻譯后修飾位點的錯誤匹配和定位。將錯誤匹配和定位的翻譯后修飾肽段作為譜圖庫，就會導致 DIA 解析結果的錯誤。這是目前翻譯后修飾 DIA 分析的瓶頸所在。
基于 Proteome Discoverer 的 phosphoRS/ptmRS 算法能夠對可能發生修飾的位點進行打分（Site Probability），判斷定位的準確性。通常認為 Probability _ 75（100 分制）或 0.75（1 分制）的位點定位準確、可靠；具有多個修飾位點的肽段，其所有位點的 Probability 均 _ 75（或 0.75），則修飾位點及 isoform 唯一確定。通過這一方法，篩選出位點準確可信、isoform 唯一確定的 PSM（即 Isoform Confidence Probability 75（或0.75）建立譜圖庫，實現精確的翻譯后修飾 DIA 分析。整個流程如圖 1 所示。
圖 1. 精確修飾位點譜圖庫建立流程圖