糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測的方法很多，測定方法主要有四類：色譜法、電泳法、免疫法和化學法。色譜法主要有離子交換層析法、高壓液相色譜法（HPLC）和親和層析法等。
成人紅細胞中的血紅蛋白有HbA（占95％～97％以上），HbA2（占2.5％），HbF（占0.2％）。當HbA中的部分血紅蛋白被糖基化后，其中由于HbA的β鏈N末端的纈氨酸分子與葡萄糖等己糖分子相結合而使其在血紅蛋白電泳中成為HbA之前的快泳、HbA1組分，在離子交換柱層析中亦在HbA之前首先被洗脫，糖化Hb可分為HbA1a（其中與1，6-二磷酸果糖結合的為HbA1a1；與6-磷酸葡萄糖結合的為HbA1a2），HbA1b（尚無明確定義，包括HbA1b1，HbA1b2，HbA1b3），HbA1e（與葡萄糖結合）和HbA1d（α鏈和β鏈內氨基以及α鏈的N末端基團上的烯化血紅蛋白；包括HbA1d1，HbA1d2，HbA1d3）共九種。最重要的是HbA1c.HbA1e的生成量取決于血糖的濃度，正常人約占4％～6％。由于紅細胞的半壽期是60天，所以GHb的測定可以反映測定前8周左右病人的平均血糖水平。
目前最常用的HbA1c測定方法是離子交換層析法和電泳法。前者精密度高、重復性好且操作簡單，已被臨床廣泛采用。國內主要采用Bio-Rex70陽離子樹脂微柱層析法，其微柱可重復使用多次。正常參考值：HbA1c：X±2s＝6.5±1.5%；＞8.0%為HbA1c增高。
離子交換層析法 分手工和自動兩種。手工微柱有Bio-Rad和西班牙BIOSYSYEMS等多家公司產品，手工微柱操作會受到人工因素影響，可能會洗脫不完全或過度洗脫，并受外界環境溫度的影響，而某些血紅蛋白如HbF異常增加時，也會與糖化血紅蛋白同時洗脫，從而使結果產生偏差。 相應的儀器以英國DREW SCIENTIFIC公司DS5糖化血紅蛋白儀為例（BIO-RAD公司DIASTA亦為同一產品），采用微柱法離子交換層析和梯度洗脫技術可全自動分離血紅蛋白的變異體與亞型，除可測定糖化血紅蛋白外，還可同時檢測出HbS與HbC的存在與否，在計算糖化血紅蛋白值時會自動扣除變異體產生的影響，從而使結果更為準確，可靠，CV值小于2%。同時該儀器配有專門的稀釋溶血器，可直接進行全血操作，5分鐘即可報告結果，并自動儲存樣品檢測結果，層析柱價格也較為低廉，適合于較多標本的醫院檢測。更大型的儀器有DREW SCIENTIFIC公司的Hb-Gold，除可全自動測定糖化血紅蛋白外，還可分離檢測血紅蛋白的600多種變異體和亞型，用于地中海貧血等疾病的診斷。
親和層析 是目前糖化血紅蛋白檢測的新方法，該方法特異性強。英國DREW SCIENTIFIC公司的DSI糖化血紅蛋白分析儀日前剛剛獲得美國食品藥品管理署（FDA）的認可獲準上市，作為目前世界唯一的快速床邊糖化血紅蛋白儀，它采用硼酸親和層析法，只需10ul全血即可在4分鐘內快速分離檢測糖化血紅蛋白，為臨床提供即時的化驗結果，尤其對于小兒患者而言更有優勢。其檢測結果也完全達到并超過臨床要求，CV值在5%以內。
高壓液相－檢測糖化血紅蛋白HbA1c的金標準 。儀器有Bio-Rad公司的VariantⅡ等，可全自動分離測定糖化血紅蛋白及血紅蛋白的變異體和亞型，但儀器的操作保養要求較高。 美國早已實行了糖化血紅蛋白檢測的標準化，統一采用高壓液相色譜法（HPLC法）檢測糖化血紅蛋白，目前美國ADA已將HbA1c作為診斷糖尿病的新指標。
免疫凝集法 原理是糖化血紅蛋白與相應的單抗結合進而發生凝集反應，通過測定吸光度來表示凝集量，可用于全自動生化分析儀上進行測定。要求對樣品成批試驗，每次試驗均應使用一個新試劑盒，操作前應注意混勻試劑。免疫凝集法測定，精密度較差，CV值一般大于6%。
離子捕獲法 亦是新近發展起來的新方法，代表儀器有Abbott的IMX，其原理是糖化血紅蛋白與相應抗體結合后，聯以熒光標記物，形成一反應復合物，再聯結帶負電荷的多聚陰離子復合物，而在IMX反應孔中的玻璃纖維預先包被了高分子的四胺合物，使纖維表面帶正電，使前述的反應復合物吸附在纖維表面，經過一系列清洗后測定其熒光強度，從而得到糖化血紅蛋白的濃度，該方法適用于成批糖化血紅蛋白標本的檢測。
電泳方法 如毛細管電泳也能分離檢測糖化血紅蛋白和血紅蛋白的變異體，但目前尚無商品化，具有批量樣本通過能力的儀器面世，相當程度地限制了該方法的臨床應用，但優點是成本低廉、普及性強。