【己糖激酶】或肝中【葡萄糖激酶】催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，由ATP提供能量和磷酸基團。這一步反應不僅活化了葡萄糖，使其能進入各種代謝途徑，還能捕獲進入細胞內的葡萄糖，使之不再透出細胞膜。反應不可逆，反應過程中消耗1分子ATP。己糖激酶或葡萄糖激酶是糖酵解途徑的第一個限速酶。
【磷酸果糖激酶-1】催化6-磷酸果糖轉變為1,6-二磷酸果糖，這是酵解途徑中的第二個磷酸化反應，需要ATP和Mg，反應不可逆。磷酸果糖激酶-1是糖酵解過程中最重要的限速酶。此酶為變構酶。檸檬酸、ATP為變構抑制劑，ADP、AMP和 F-1,6-BP等為變構激活劑。胰島素誘導其生成。
【丙酮酸激酶】催化磷酸烯醇式丙酮酸轉變為丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸鍵在催化下轉移給ADP生成ATP，自身生成烯醇式丙酮酸后自發轉變為丙酮酸。反應不可逆。是糖酵解途徑中第二個以底物水平磷酸化方式生成ATP的反應。丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的又一個限速酶，具有別構酶特性，ATP是其別構抑制劑，ADP是別構激活劑。