一、實驗目的
1.學習紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理。
2.掌握紫外分光光度法測定蛋白質含量的實驗技術。
3.掌握TU-1901紫外-可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構造。
二、實驗原理
1.紫外-可見分光光度法，是以溶液中物質的分子或離子對紫外和可見光譜區輻射能的選擇性吸收為基礎而建立起來的一類分析方法。
紫外光：10-400 nm
可見光：400-780 nm，（可被人們的眼睛所感覺）
特點：帶光譜、分子光譜
應用：定性分析-最大吸收波長；
定量分析-朗伯-比爾定律（標準曲線法和標準加入法）
a.定性分析原理：
吸收曲線：吸收峰的數目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀.
b.定量分析原理：
根據朗伯－比耳定律：A=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內，有色物質的吸光度A與該物質的濃度c成正比。
定量分析常用的方法是標準曲線法即只要繪出以吸光度A為縱坐標，濃度c為橫坐標的標準曲線，測出試液的吸光度，就可以由標準曲線查得對應的濃度值，即未知樣的含量。
c.儀器組成部件:
各種類型的紫外-可見分光光度計，如下圖所示，從總體上來說是由五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示記錄裝置。
三、儀器與試劑
TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管（10ml的5個），吸量管、標準蛋白質溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測蛋白質溶液（牛血清白蛋白）。
四、實驗步驟
1.基本操作
（1）啟動計算機，打開主機電源開關，啟動工作站并初始化儀器,預熱半小時。
（2）用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL標準蛋白質溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比（參比溶液不可取出）.
（3）在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描，設置掃描參數（起點：400nm，終點：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描）
（4）將兩個均裝有0.9%NaCl溶液的25px石英比色皿放入測量池中，進行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調回光譜掃描。
2.吸收曲線的制作:
將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質溶液，點擊START進行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標準蛋白質溶液的最大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為0.1984。
3.標準曲線的制作：
在工作界面上選擇測量項目為光度測量設置測量條件（測量波長：278.00 nm）。
用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在278nm處分別測定以上所配標準溶液的吸光度A278，記錄所得讀數。
4.樣品測定：
配制三份待測蛋白質溶液，（取待測蛋白質溶液2.0mL分別于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出待測蛋白質的濃度為0.6101mg/mL。轉換后待測蛋白質溶液的濃度為3.0505mg/mL。
六、注意事項
PH最好與標準曲線制作時的PH值一致。
2.在測量前應把機器預熱半小時。
3.吸收曲線繪制前必須進行光譜的掃描。
4.溶液一定要配制準確,以防影響實驗效果,保證點在一條直線上。
5.在作標準曲線進行定量前一定要選擇最大的吸收波長,確保靈敏度高。
6.在實際操作中，比色皿在使用中應注意保持干凈，更不能觸摸比色皿的光面，以防摩擦影響通光。