試劑、試劑盒 乙酸鈉NaCl抗壞血酸勻漿緩沖液洗脫緩沖液
儀器、耗材 液氮研缽和研杵布氏漏斗真空室或真空泵
實驗步驟
3.1 組織破碎、清洗、凝膠檢測純度
( 1 ) 收集 7~8 g 成熟（節間 4~6 ) 紫花苜蓿莖。這一重量的成熟莖組織這一數量中含有的細胞壁的蛋白質應多于 1 mg ( 見注釋 2) 。收集后 -80°C 貯存或立即進入下一步。
( 2 ) 所有的溶液置于冰上。
( 3 ) 把莖剪成小塊，1~2 cm 的長度，使研磨更容易。
( 4 ) 凍結的組織解凍（見注釋 3) 。
( 5 ) 用研缽和研杵磨碎直至組織起泡沫（見注釋 4 ) 。確定組織研磨好了。先在沒有緩沖液條件下磨碎，然后添加 10 ml 的勻漿緩沖液再研磨一次。
( 6 ) 將研磨好的組織放在鋪于布氏漏斗和真空過濾器的尼龍網過濾紙上。用刮板在濾紙上均勻鋪平組織。用 15 ml 的勻漿緩沖液沖洗研缽和研杵，并用它來洗/過濾剩下的細胞碎片（見注釋 5 ) 。每次用 25 ml 的緩沖液沖洗碎片顆粒 3 次以上，每 7~8 g 初始組織總共用 100 ml ( 約 14 ml 緩沖液/g) ( 見注釋 6 ) 。采用真空泵去除洗液。保留洗液部分以測定純度（見注釋 7)。純度檢測的適當方法為 SDS-PAGE 分析（圖 10-1A ，泳道 1 ) 或以已知胞內蛋白質的抗體進行 Western 雜交（圖 10-1B ，條帶 2 )。
( 7 ) 用 50 ml 洗滌緩沖液 1 ( 氯化鈉洗液，見注釋 8 ) 清洗碎片。把它倒在放于尼龍過濾膜上的細胞碎片并且通過真空抽濾去除。當加入洗液時關閉真空泵并確保洗液接觸了所有碎片。保留洗液部分，以測定純度（圖 10-1A ，泳 道 2；圖 10-1A，泳道 3) 。
( 8 ) 用 50 ml 蒸餾水重復清洗 2 次（圖 10-1A，泳道 3；圖 10-1B ，泳道 4 ) 。
( 9 ) 用 50 ml 冰冷丙酮沖洗 5 次（見注釋 9；圖 10-1A，泳道 4) 。
( 10 ) 重復步驟 9 ( 圖 10-1A ，泳道 5) 。
( 11 ) 最后用 50 ml 洗滌緩沖液 2 洗一遍（10 mmol/L 乙酸鈉；圖 10-1A ，泳道 6；圖 10-1B，條帶 5 ) 。
3.2 提取細胞壁的蛋白質
( 1 ) 把細胞碎片放入中在冰上的 50 ml 管子里并且添加 7.5 ml 提取緩沖液 1 ( 氯化鈣緩沖液)。傾向一邊放置管子以增加細胞碎片接觸提取緩沖液的表面積。固定在搖床上輕搖 30~45 min。
( 2 ) 收集蛋白質提取液（見注釋 10 )，水上再次加入適量的提取緩沖液重復提取 30~45 min ( 見注釋 11)。
( 3 ) 去除第二次的蛋白質提取液，將所得提取物與第一次的提取物合并。添加 15 ml 提取緩沖液 2 ( 氯化鋰緩沖液）并且提取物在冰中放置至少 45 min 或在低溫盒里過夜（見注釋 12 和注釋 13 ) 。
( 4 ) 在把提取物放入濃縮儀之前于 4°C 離心機稍稍離心（約 1000 g ) 以去除顆粒物。
3.3 蛋白質濃縮和脫鹽
( 1 ) 根據儀器說明書的說明用離心濃縮儀濃縮樣品（見注釋 14)。我們偏向用 15 ml 的 Amicon 超速離心過濾設備。提取物可以在此步驟分開或合并。濃縮到 100~150 μl。
( 2 ) 來自 Bio-Rad 的 ReadyPrep 2-D 去除試劑盒，容納鹽的濃度髙達 1 mol/L，由于氯化鋰提取物是在 3 mol/L 的氯化鋰中，通過向濃縮樣本中加入 2 體積蒸餾水來脫鹽，將樣品再次濃縮。把蛋白質溶液轉入一個 microfuge 管，把 200 μl 的槍頭減去槍尖可能有助于從濃縮儀中轉移樣品。用小體積（約 100 μl ) 的蒸餾水或緩沖液沖洗濃縮儀的膜并與濃縮的蛋白質合并起來。
3.4 蛋白質清洗，樣品的水化和濃度的測定
( 1 ) 確定蛋白濃度，使用 Bradford 法或相應的方法。
( 2 ) 在這個階段的細胞壁制備物，不進行任何進一步清洗就可用于 SDS-PAGE ( 圖 10-2，泳道 1 和泳道 2) ，但蛋白條帶不會像那些經過商業試劑盒處理并用 SDS 樣品緩沖液溶解的那樣清晰（圖 10-2，泳道 3 和泳道 4）。
( 3 ) 對 2-DE ( 圖 10-3A，氯化鈣和氯化鋰提取物相結合；圖 10-3B，氯化鈣提取物；圖 10-3C，氯化鋰提取物）來說，使用 ReadyPreP 清除試劑盒（見注釋 15 ) 或其他商業化的試劑盒（見注釋 16 ) 處理。然后復水緩沖液中重新懸浮。Bio-Rad 試劑盒的作用量為 100 μl 中的 1~500 μg 的蛋白質。