紅細胞和白細胞計數的參考方法

前  言

為了保證紅細胞和白細胞的計數結果具有溯源性和準確性，特制定本標準。

本標準從200X年X月X日起實施。

本標準由衛生部醫政司提出。

本標準起草單位：衛生部臨床檢驗中心

本標準主要起草人：彭明婷、申子瑜、谷小林、陸紅、楊振華。

本標準由衛生部委托衛生部臨床檢驗中心負責解釋。

中華人民共和國衛生行業標準

1 范圍

本標準規定了建立紅細胞和白細胞計數參考方法的技術要求。

本標準適用于建立紅細胞和白細胞計數參考方法的實驗室。

2 規范性引用文件

    國際血液學標準化委員會（ICSH）-1994  紅細胞和白細胞計數的參考方法

3 定義

    參考方法（Reference method） 

    一種可清楚和準確描述的用于特定檢測的技術，該技術要有依據，可提供高度準確和精密的實驗數據以評價其他實驗方法檢測結果的有效性。若有決定性方法，參考方法的準確性必須與決定性方法進行比較。參考方法應溯源至一級計量標準并且須標示不準確度和不精密度。

4 總則

4．1  要求使用單通道、阻抗原理的半自動電子計數儀來建立紅細胞和白細胞計數的參考方法。

4．2  為了保證參考方法檢測結果的精密度和準確性，建立參考方法的實驗室之間必須進行比對。

5  紅細胞和白細胞計數參考方法的一般技術要求

5.1 血標本

5.1.1  用符合要求的塑料注射器或真空采血系統采集新鮮靜脈血標本。標本中不得有肉眼可見的溶血或小凝塊。

5.1.2  標本的收集要求使用EDTA二鉀作為抗凝劑，抗凝劑的濃度為3.7-5.4

μmol/ml血 (1.5-2.2 mg/ml血)。盛有標本的試管應有足夠的剩余空間以便于血標本的混勻操作。

5.1.3  標本應置于18℃~22℃ 的溫度條件下直至檢測。

5.1.4  標本采集到標本檢測的時間間隔應不超過4小時。

5.1.5  檢測前應輕輕地顛倒盛有標本的試管，以便將標本充分混勻。不得使用混勻器進行混勻操作。

5.2 加樣器

要求使用經過校準的移液器，不準確度≤±0.5%。其不準確度應溯源至一級計量標準。

5.3 容量瓶

要求使用硅硼玻璃制成的一級容量瓶。每個容量瓶應有經國家標準計量機構檢定的標示體積，其不準確度為±1 %。

5.4 計數杯

5.4.1 計數杯的體積應有10ml。

5.4.2 計數杯應有足夠的高度以保證在計數前電子細胞計數儀小孔管的小孔約在液體高度一半的位置，完成計數后在小孔上方至少有1cm的液體高度。

5.4.3 使用前要保持計數杯的清潔，無化學污染物和顆粒物。

5.4.4 須確認是否因細胞粘附于計數杯上而導致計數值的持續下降。從每批計數杯中抽查檢測。在計數杯內加入稀釋樣本，放置不同的時間進行檢測，以確認計數杯是否合格。臨計數前，樣品杯內的稀釋液必須充分混勻。

5.5 儀器性能

5.5.1 電子細胞計數儀的設計要達到每個細胞只能計數一次的要求。細胞通過計數敏感區時顆粒回流的可能性要很小，由此產生的脈沖應低于相應的低閾值。5.5.2 電子計數裝置應有能力通過脈沖高度來區分檢測的細胞、其它細胞和電噪聲，且能保證檢測誤差足夠小。

5.5.3 儀器小孔的直徑為80~100μm，小孔長度為直徑的70~100%。

5.5.4 計數過程中吸入的標本體積的準確度要求在1%以內，準確度應溯源至國家或國際計量標準。

5.5.5 通過水銀柱或其他適當物質的移動吸入標本。吸入標本的體積受溫度影響的程度應小于每攝氏度0.1%。

5.5.6 為了避免人為因素的影響，設定閾值時要求保證信噪比在100：1以上。

5.6 試劑

5. 6.1 稀釋液

5.6.1.1 稀釋液應為無菌、無毒、適用于檢測系統的緩沖鹽溶液。

5.6.1.2 要求標示稀釋液的滲透壓，滲透壓的大小在280±15mOsm范圍內。

5.6.1.3 在設定的閾值條件下，稀釋液的空白計數應少于1×10⁵個/L。

5. 6.2 溶血劑

在全血標本中計數白細胞時，紅細胞須首先被溶解。溶血劑的作用不能影響白細胞計數，同時紅細胞的碎片應被減至不被當作白細胞計入。

5. 6.3 沖洗液

沖洗液由稀釋液經真空脫氣或加熱至90℃以去除氣體。

6 紅細胞計數方法的要求

6. 1 沖洗

 計數前用沖洗液沖洗儀器。

6. 2 重疊計數校正的稀釋要求

計數的每一份標本都要進行重疊校正。

進行重疊校正的標本稀釋方法和檢測次數：制備2份稀釋原液（每份0.1ml血加20ml稀釋液）。取0.02、0.04、0.06和0.08ml稀釋原液分別加入20ml稀釋液中以制備兩套4個濃度的次級稀釋標本，濃度最高的次級稀釋標本為0.08＋20ml，稀釋倍數為1/50451。每份次級稀釋標本的計數次數如下所示：

次級稀釋標本  0.02+20    0.04+20    0.06+20    0.08+20

計數次數       12          6          4          3

6．3 將稀釋標本移入計數杯

    稀釋標本應移至計數杯內，輕輕混勻約30秒，混勻過程中不能有氣泡。計數應在稀釋后5分鐘內完成。

6．4 計數過程

6.4.1 樣本通過小孔的時間可依照制造商的推薦而定。

6.4.2 按6.2規定的檢測次數，對每份次級稀釋標本進行重復檢測。

6. 5 閾值的驗證

  將低計數閾值設在血小板和紅細胞脈沖信號之間波谷的位置。

6. 6 重疊計數的校準方法

     重疊計數的校正是使用回歸分析方法來檢查回歸的線性；分析的數據點由檢測兩套4個濃度的次級稀釋標本得出。Y軸代表每個水平的次級稀釋標本的累積計數值，X軸上的刻度將最高濃度次級稀釋標本（0.08+20ml）的濃度定為1.0。

次級稀釋標本(ml) 0.02+20   0.04+20   0.06+20   0.08+20

X軸的刻度值    0.2507     0.5010    0.7507    1.0000

如果變異的分析未顯示非線性，那么回歸直線的交叉點代表重疊校準的計數值。

計數值為吸入小孔管的二級稀釋最大濃度標本（0.08+20ml）的紅細胞計數值。由于重復測定了3次，故用該計數值除以3。結果代表每毫升通過小孔的二級稀釋標本內含的細胞數。最后，用計數值乘以50451得出RBC的計數值。

7  白細胞計數方法的要求

    前述的原理同樣適用于白細胞計數。制備雙份稀釋標本，每0.08ml血加入20ml稀釋液中。計數前加入溶血劑。在確保紅細胞完全溶解、紅細胞殘骸不至計入白細胞、溶血劑對白細胞計數發生影響之前，對白細胞進行計數。計數紅細胞的小孔管可用于白細胞計數。

7. 1 閾值的驗證

    原理同紅細胞計數，低閾值設在紅細胞碎片引起的噪聲和白細胞信號之間。

7. 2 重疊校準

    與紅細胞計數的操作相同，按如下要求制備4份原級白細胞稀釋標本：

0.02+20ml    0.04+20ml    0.06+20ml    0.08+20ml

回歸線的交點代表最大濃度原級稀釋標本（0.08＋20ml）的重疊校準值。重復檢測的次數與6.2相同。用計數值乘以251得出白細胞的計數值。

7. 3 誤差分析

    紅細胞計數的最大允許偏倚為2.0%，白細胞計數的最大允許偏倚為4%。

7. 4 樣本誤差

    如果檢測樣本不能代表全血標本則說明存在誤差。考慮的影響因素應包括混勻效果欠佳，取標本時溶血和稀釋不準確等。

7. 5 輸送過程的誤差

    如果已知體積稀釋血的某個細胞未被計數則會引起此項誤差，該誤差可由于細胞沉降、丟失和/或回流和吸入體積的不準確而產生。

7. 6 計數誤差

7.6.1 由于不當的識別、假性計數或不當的重疊校準都可導致最后的計數值不正確。細胞計數參考方法的不精密度應小于1%。

7.6.2 潛在的誤差來源包括標本的采集、稀釋、吸入體積的不精密度和細胞計數值的范圍等。

編制說明

   制定本標準的依據是國際血液學標準化委員會（ICSH）頒布的文件《紅細胞和白細胞計數的參考方法》。

在制訂本標準的過程中，以書面形式征求了專家意見并召開了專家研討會，根據專家意見對本標準進行了修改。本標準的制訂對于在我國直接建立紅細胞和白細胞計數的國際標準，保證紅細胞和白細胞計數檢測結果的溯源性具有重要意義。

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