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  • 纖維素酶(cellulase,CL)/羧甲基纖維素酶活性測定 試劑盒說明書

    分光光度法 50 管/24 樣

    正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

    CL(EC 3.2.1.4)存在于細菌、真菌和動物體內,能夠催化纖維素降解,是一類可廣泛應用于醫藥、食品、棉紡、環保及可再生資源利用等領域的酶制劑。

    測定原理: 

    采用蒽酮比色法測定CL催化羧甲基纖維素鈉降解產生的還原糖的含量。

    需自備的儀器和用品:

    可見分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。

    試劑的組成和配制:

    提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 6mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 40mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存; 臨用前加入 5mL 蒸餾水和 45mL 濃硫酸充分溶解待用。

    樣品測定的準備:

    1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量

    (104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

    2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

    3、血清(漿)樣品:直接檢測。

    測定步驟:

    1、 分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 620nm,蒸餾水調零。

    2、加樣表(在 EP 管中依次加入下列試劑):

    試劑名稱

    對照管

    測定管

    樣本

    100

    100

    試劑一(μL )


    180

    試劑二(μL )

    740

    740

    蒸餾水(μL )

    360

    180

    37℃振蕩反應 1h 后,90℃水浴 15min(蓋緊,防止水分散失),冷卻后

    8000g 25℃離心 10min,取上清,得糖化液

    糖化液 (μL)

    350

    350

    試劑三 (μL)

    650

    650

    混勻, 90℃水浴 10min(蓋緊,防止水分散失),冷卻,620nm 處蒸餾水調零,測定吸光值

    A,計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管設一個對照管。

    CL 活力計算:

    1、標準條件下測定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462;x 為標準品濃度(mg/mL),y 為吸光值。

    2、血清(漿)CL 活力的計算

    單位的定義:每 mL 血清(漿)每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

    CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V 樣÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

    3、細胞、細菌和組織中 CL 活力的計算

    (1) 按照蛋白濃度計算

    單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

    CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

    =39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

    (2) 按樣本鮮重計算

    單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

    CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

    =39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

    (3) 按細菌或細胞密度計算

    單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

    CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

    =0.0796×(ΔA+0.0462)

    1000:1mg/mL=1000ug/mL;V 反總:反應體系總體積,1.2mL; V 樣:加入樣本體積,0.1

    mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,60 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;

    W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。


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