前體 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR（serine/argininc rich，富含絲/蘇氨酸）蛋白家族是將剪接體組裝到前體 mRNA 上的重要參與者。SR 蛋白是重要的剪接因子，該家族的不同成員可以在體外或體內指導選擇性剪接位點的選擇。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 前體 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR（serine/argininc rich，富含絲/蘇氨酸）蛋白家族是將剪接體組裝到前體 mRNA 上的重要參與者。SR 蛋白是重要的剪接因子，該家族的不同成員可以在體外或體內指導選擇性剪接位點的選擇。 |
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| 實驗材料 | 超純硫酸銨 |
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| 試劑、試劑盒 | SR 蛋白提取緩沖液SR 透析緩沖液丙烯酰胺溶液蛋白加樣緩沖液丙酮鹽酸胍考馬斯亮藍染色液 |
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| 儀器、耗材 | 大探頭超聲儀相差顯微鏡離心機離心管透析袋聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. 從細胞和組織中純化 SR 蛋白家族
(1) 低速離心收集培養至對數生長中期的細胞，4℃ PBS 洗 2 次，離心收集細胞并保存于 -80°C 備用。以下制備實驗通常使用6X109~ 8X1011 個 HeLa 細胞或 4X1010~5X1015 個果蠅 Kc 細胞。將細胞沉淀在液氮中研磨成粉末，注意在加入提取緩沖液之前應將研缽置于干冰上預冷。
(2) 動物器官和組織可用下述方法制備。確保動物死后幾分鐘之內將組織保存于液氮或干冰中，用研缽將組織研成粉末，研缽應置于干冰上或液氮中，在研磨過程中應不斷添加液氮，研碎的組織可保存于 -80℃ 備用。
(3) SR 蛋白提取緩沖液：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.6 )，67 mmol/L KCl，13 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，5 mmol/L KF，5 mmol/L β-磷酸甘油，0.2 mmol/L PMSF，配制 500 ml。
(4) SR 透析緩沖液：10 mmol/L HEPES-KOH（pH 7.6 )，67 mmoI/L KCl，13 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，5 mmol/L KF，5 mmol/L β-磷酸甘油，0.2 mmol/L PMSF，配制 4 L。
(5) 緩沖液 D：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.6 )，5% ( V/V ) 甘油，0.1 mol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L DTT，配制 50 ml。
(6) 大探頭超聲儀：Branson 超聲破碎儀 450 或同等的儀器，直徑 0.5 英寸（1 英寸=2.54 cm ) 破碎探頭。組織培養細胞以及研碎的組織置于 600 ml 燒杯中，在提取緩沖液中破碎。
(7) 相差顯微鏡，監測超聲過程中鈿胞破碎情況。
(8) 離心機及離心管：Backman J2 或等同離心機，JA-17 或等同轉子，帶蓋 50 ml 聚丙烯離心管。
(9) 超速離心機和離心管：Beckman L7 或等同離心機，SW-28 或等同大容量吊桶轉子以及配套離心管。
(10) 超純硫酸銨：在使用前用研缽仔細粉碎。
(11) 90% 硫酸銨 SR 透析緩沖液：66.2 g 硫酸銨溶于 100 ml SR 透析緩沖液。
(12) MWCO ( 截留分子質量）6000~8000 透析袋，透析袋在 10 mmol/L NaHCO3 中煮 10 min，再在 10 mmol/L EDTA 中煮 10 min，再將透析袋在去離子水中充分沖洗，保存于 50% 乙醇中，置 4℃ 備用，然后用蒸餾水清洗透析袋，用于從分離物中透析硫酸銨。
(13) Eppendorf 5415 C 或等同臺式離心機。
(14) 硅烷化的 1.7 ml 微量離心管。
(15) 1 moI/L MgCl2 溶液。
(16) 杯-角超聲波探頭：直徑 2 英寸，Branson Ultrasonic 生產（Danbury，CT，USA ) 或等同儀器。Mg2+ 沉淀的 SR 蛋白通過超聲重懸于緩沖液 D 中。
2. 從變性聚丙烯酰胺凝膠中分離單一 SR 蛋白
(1) 16 cm 高垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置，0.75 mm 厚的墊片及用于制備凝膠的梳子。
(2) 10% 丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰胺 29.2：0.8。電泳緩沖液：0.025 mol/L Tris 堿，0.192 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS。分離膠溶液：10% 丙烯酰溶液，0.375 mol/L Tris-HCl（pH 8.8 )，0.1% SDS。濃縮膠丙烯酰胺溶液：4% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰 29.2：0.8），0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8 )，0.1% SDS。
(3) 0.25 mol/L KCl，4℃ 預冷。
(4) 2X蛋白加樣緩沖液：0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)，4% SDS，20% 甘油，10% β-巰基乙醇。
(5) 蛋白洗脫緩沖液：0.1% SDS，50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)，5 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，0.1 mg/ml 乙酰化牛血清白蛋白，使用前現配。
(6) 丙酮，預冷至 -20℃。
(7) 微量離心機，預冷至 -20℃。
(8) 6mol/L 鹽酸胍，用緩沖液 D 配制。
(9) MWCO 6000~8000 透析袋，微透析腔。微量透析儀：Spertrum Spcctra/por (Houston, TX, USA)。
(10) 考馬斯亮藍染色液：0.125％ 考馬斯亮藍 R250 溶于 50% 甲醇、10% 乙酸中。染色 20 min 后脫色，先在 50% 甲醇和 10% 乙酸中脫色 15 min，再用 5% 甲醇和 7% 乙酸脫色。
二、操作方法
1. 純化 SR 蛋白家族 65%~90% 硫酸銨組分
(1) 在 600 ml 燒杯中加入適量的細胞如約 5X1011 哺乳動物組織培養細胞，4X1010 昆蟲組織培養細胞或 100 g 粉狀組織如牛胸腺（保存于 -80℃），加入 330 ml 預冷至 4℃ 的 SR 提取緩沖液，置于冰上。在燒杯中加入攪拌子，將冰凍的粉狀物和緩沖液攪勻。
(2) 4°C 攪拌 5 min。
(3) 用大探頭于 4℃ 超聲破碎細胞，將超聲儀功率調至將近最大值。用攪拌每隔 30~60 s 攪拌一次以保證均勻超聲。每 5 min 用顯微鏡檢杳細胞破碎情況，可能組織需要時間長達 15 min，而培養的細胞則只需 5 min，在超聲前制備涂片作為對照。
(4) 將樣品移入預冷的 50 ml 離心管中，用 JA I7 轉子于 4℃ 10000 r/min 離心裂解細胞 20 min。
(5) 離心后，將離心管置于冰上，去除提取物上層的脂層，將所有上清液合并于預冷的 600 ml 燒杯中，置于冰上。用預冷的 500 ml 量筒測定提取物的準確體積。
(6) 在燒杯中加入磁力攪拌子，4℃ 緩慢攪拌，緩慢加入研細的硫酸銨，在 15~20 min 內達到 65% 的飽和度。在使用前要確保硫酸銨為細粉末，可用研缽粉碎（要達到仍 65％ 的飽和度，在每毫升提取物中加入 0.43 g 硫酸銨。
(7) 當所有的硫酸銨加完后，4℃ 攪拌 1.5 h。
(8) 將提取物轉移到 50 ml 預冷的離心管中，用 JA-17 轉子 10000 r/min 離心 20 min。
(9) 離心后，將管置于冰上，去除上層脂層。
(10) 將上清倒入干凈預冷的 50 ml 離心管中，用 JA-17 轉子 4℃ 10000 r/min 離心 20 min。
(11) 離心后，將管置于冰上，去除上層可能存在的脂層。
(12) 將所有的上清并入預冷的 600 ml 燒杯中，置于冰上，用預冷的 500 ml 量筒測定提取物的準確體積。
(13) 在燒杯中加入磁力攪拌子，4℃ 緩慢攪拌，加入研細的硫酸銨，在 15~20 min 內達到 90% 的飽和度（為了達到 90% 的飽和度，在每毫升含硫酸銨的提取物中加入 0.19 g 硫酸銨）。
(14) 用塑料膜封住燒杯口，攪拌提取液過夜。
(15) 第二天，將樣品分裝于預冷的微量離心管中。
(16) 在 Beckman L7 超速離心機上使用 SW28 轉子，于 8°C 25000 r/min 離心 1 h。
(17) 緩慢棄去離心管中的上清。
(18) 沿管壁緩慢加入 3 ml 預冷至 4℃，含 90% 硫酸銨的 SR 透析緩沖液，小心勿觸動沉淀。
(19) 在置于冰上的每個離心管中加入 0.5 ml SR 透析緩沖液（不含硫酸銨）。
(20) 將所有懸浮的沉淀并入一個管中。用 1 ml SR 透析緩沖液依次沖洗離心管，將洗滌液并入樣品管中，此時樣品的總體積應為 6 ml 左右。
(21) 用蒸餾水清洗 15.24~17.78 MWCO 6000~8000 透析袋，用夾子夾住袋底。
(22) 將重懸的沉淀物移入透析袋中，夾緊袋子上部。
(23) 用 1300 ml SR 透析緩沖液于 4℃ 透析 1 h。
(24) 更換緩沖液，再用 1300 ml 緩沖液透析 2 h。
(25) 再更換 1300 ml 緩沖液，于 4℃ 透析過夜。
(26) 第二天，將透析過的溶液分裝于 1 ml 硅化的微量離心管中。
(27) 將離心管置于干冰上進行速凍。
(28) 制備溶液時可長期保存于 -80℃。
2. SR 蛋白的沉淀
(1) 在冰浴中解凍透析過的 65％~90% 硫酸銨組分。
(2) 離心去除沉淀的蛋白，在微量離心機上于 4°C 14000 g ( 13000 r/min ) 離心 30 min。對于較大體積的蛋白樣品，可將透析的組分移入 15 ml Corex 離心管中，用 JA17 或等同的轉子于 4℃ 10000 r/min（10000 g）離心 30 min。
(3) 用移液器將澄清的上清轉移到新的預冷的 Corex 管或硅化的微量離心管中，避免吸到沉淀，注意寧可損失一些上清也不要帶入沉淀物。
(4) 加入 1 mol/L MgCl2 溶液至上清液中，終濃度為 15 mmol/L 混勻，將離心管置于冰上 1 h。
(5) 按第 (2) 步離心 MgCl2 處理過的溶液。
(6) 棄上清，吸取少量 SR 透析緩沖液（含 20 mmol/L MgCl2）至離心管中用以清洗沉淀物。注意少量，能夠覆蓋沉淀即可，盡量去除清洗緩沖液，可以短暫離心以保證清冼緩沖液集中于管底并完全去除。
(7) 將沉淀重懸于緩沖液 D 中，對于 Corex 離心管中的沉淀，吸取 200~400 μl 緩沖液 D 并輕輕上下吹打，注意吹打動作要輕以免樣品損失。將重懸的沉淀轉移到硅化的微量離心管中，再用 100 μl 緩沖液 D 沖洗離心管，將洗液并入微量離心管中。對于微量離心管中的沉淀，每毫升 65%~90% 透析過的硫酸銨組分所得沉淀加入 20~100 μl 緩沖液 D，注意不要上下吹打沉淀物。在以上兩種情況下，將微量離心管置于 4°C 杯角超聲浴中，將杯角探頭的功率設置到最大值，超聲 30 s，如有必要可重復幾次，注意保持超聲浴為 4℃。
(8) 重懸的 SR 蛋白的純度可以通過 SDS PAGE 膠電泳分析，將同一蛋白的考馬斯亮藍染色結果與 mAb104 抗體免疫印跡結果相比較以進行鑒定。根據經驗，銀染方法不適于檢測 SR 蛋白。
3. 單一 SR 蛋白的 SDS-PAGE 純化和復性
(1) 用 0.75 mm 厚的邊條，制備 5~8 cm 寬、4 cm 高的 10% 濃縮膠制備性凝膠，待凝膠聚合數小時后再使用。
(2) 在經鎂離子沉淀并重懸于緩沖液 D 的 SR 蛋白溶液中加入等量 2X 蛋白上樣緩沖液。對于上面所說的制備性凝膠，從 100 g 小牛胸腺所得的 SR 蛋白量可以取得最好的回收效果。應該注意在重懸時使樣品保持較小的體積，同時不要直接用蛋白上樣緩沖液重懸沉淀或在用于鎂離子沉淀蛋白管中加入上樣緩沖液。
(3) 樣品于 90℃ 加熱 5 min。
(4) 將樣品加樣于制備的膠中，同時預染分子質量標準蛋白上樣，另留 1% 的樣品單獨上樣，使該泳道緊靠預染分子質量標準蛋白泳道。
(5) 100V 電泳 7 h，或使指示劑電泳至凝膠底部。
(6) 取下凝膠，將預染分子質量標準及單獨上樣泳道切下，用考馬斯亮藍染色留做記錄。
(7) 將包含制備泳道及預染分子質量質標準蛋白泳道的凝膠浸于 500 ml 4℃ 預冷的 0.25 mol/L KCl 中，浸泡 10 min。
(8) 將膠置于玻璃板上，再置于黑色背景上，在有蛋白存在處，KCl 可與蛋白中的 SDS 作用，形成可見的亮白色沉淀。
(9) 將單個蛋白條帶分別用刀片切下，轉入 15 ml 錐形管中。
(10) 在每個管中加入 10 ml 4℃ 預冷的 1 mmol/L DTT，室溫浸泡 3 min，棄去管中溶液。
(11) 將研缽置于冰浴中，加液氮于研缽中，用鑷子將凝膠移入液氮中，緩慢將凝膠研成細粉。
(12) 使用在干冰上預冷的稱量紙，將研缽中的粉末狀碎凝膠轉移到 15 ml 錐形管中或硅化的 1.7 ml 微量離心管中。
(13) 加入新鮮配制的 0.5~2.0 ml 洗脫緩沖液，根據凝膠的量調整緩沖液用量，最好讓凝膠粉末和洗脫緩沖液的體積相等。
(14) 室溫條件下旋轉混合過夜，洗脫凝膠中的蛋白。
(15) 室溫高速離心 5 min，分離溶液和凝膠。
(16) 用移液器將上清移至硅化的微量離心管中，如果體積較大，則將上清分裝于多個管中，注意每管體積勿超過 800 μl。
(17) 高速離心 5 min 以將可能存在的凝膠沉淀下來。
(18) 將上清轉移至新的硅化微量離心管中，注意不要帶出可能存在的凝膠，用移液器測定每管中上清的體積。
(19) 將管置于冰鹽浴中（5 mol/L NaCl 溶液與冰混合），-20 ℃ 放置 10 min。
(20) 在每個管中加入預冷至 -20℃ 的丙酮，快速將管上下顛倒混勻，繼續置于冰鹽浴中。
(21) 將冰鹽浴中丙酮沉淀物置于 -20℃，放置 20 min。
(22) 將管置于預冷至 -20°C 的離心機中，13000 g 離心 20 min。
(23) 快速從離心機中取出離心管，并置于冰鹽浴中，立即置于冷室。
(24) 在冷室中，盡可能棄去上清，在管中加入 100 μl 用緩沖液 D 配制的 6 mol/L 鹽酸胍。
(25) 將管在 4℃ 放置 5 min。
(26) 將管置于室溫，開蓋放置 15 min，使殘留的丙酮揮發干凈。
(27) 蓋上管蓋，超聲 30 s，以利于重懸沉淀。
(28) 室溫開蓋放置 15 min。
(29) 室溫 13000 g 離心 10 min，除去不溶于鹽酸胍的蛋白。
(30) 將上淸液加入微透析裝置，用 MWCO 6000~8000 透析袋 4℃ 用蠕動泵以 1 ml/min 流速對含 5 mmol/L β-磷酸甘油的緩沖液 D 進行透析，樣品的透析最少需要 3 h，但不要超過 7 h。
(31) 將透析后的溶液移入微量離心管中，用 50 μl 緩沖液 D 沖洗透析孔，將洗液并入蛋白樣品。
(32) 4°C 13000 g 離心 30 min 以去除由于鹽酸胍被透析產生的不溶蛋白。
(33) 將上清移入新的微量離心管中，加入 1 mol/L MgCl2 至終濃度為 20 mmol/L。
(34) 將離心管置冰上，4℃ 過夜。
(35) 4°C 13000 g 離心 30 min。
(36) 去除上清，在沉淀中加入 20~60 μl 緩沖液 D。
(37) 將超聲儀功率設至最大，在冰水浴中超聲 30 s 以重懸沉淀。
(38) 取 2~4 μl 樣品進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，用考馬斯亮藍染色鑒定 SR 蛋白的純度。同時倍比稀釋已知量蛋白，上樣于同一塊凝膠，根據考馬斯亮藍染色強度大致判定制備的 SR 蛋白的濃度。 |
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