組織的分離實驗_胰蛋白酶消化消化分離法

新鮮組織

Hanks培養液胰蛋白酶

三角燒瓶吸管

使用胰蛋白酶消化細胞法如下：

1.  剪切

把組織剪切成3~5 立方毫米的小塊；

2.  加液

把組織置入三角燒瓶中（瓶內有鐵蕊的攪棒或玻璃小球），注入比組織量多30~50 倍的0.25%的胰蛋白酶（預加溫至37 ℃）；

3.  消化

置電磁攪拌器臺上，消化30~60 分鐘，或置于37 ℃水浴中，或放于37 ℃溫箱中；在兩種情況下，每隔5~10 分鐘搖動一次。如需長時間消化時，中間可更換一次消化液，然后靜置三角燒瓶，過10 分鐘，待組織下沉后，吸除2/3上清液，余1/3，再補加新胰蛋白酶液，繼續消化；

4.  消化完畢，倒入離心管中，800 轉/分，離心6~8 分鐘后吸除上清液；

5.  用Hanks液漂洗2~3 分鐘，離心去上清，共兩次；

6.  800 轉/分，離心5 分鐘后去上清，加入一定量的營養液，通過100 微米/網眼的尼龍網或不銹鋼紗網濾過，以除掉未充分消化的較大塊的組織；如消化徹底可不過濾。用吸管吸取一滴細胞懸液滴于載物片上觀察，如細胞分散良好、形態完整、即可用于培養。濾過時用3~4 層無菌紗布亦可。

1.  在37 ℃溫度下用胰蛋白酶長時間（1 小時以上）消化纖維性組織時，組織塊表層細胞可隨時從纖維網架中脫落下來。

2.  因此每隔20~30 分鐘，需用不銹鋼網（20~50 微米）濾過一次，離心，收集這些細胞，以免它們被消化過度受破壞。

3.  如系冷消化，在從4 ℃中取出后，亦應先濾過一次，離心，除上清，收集已游離下來的細胞；再向消化容器中寂足新胰蛋白酶液，并再重置入37 ℃溫箱中，繼續溫消化剩余組織20~30 分鐘，這樣可能效果更好。