細胞傳代培養（消化法）

 細胞傳代培養（消化法）

一. 傳代前準備：

1. 預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。

6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

二.胰蛋白酶消化；

1. 加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰  蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。
   

   2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。
   

   3.吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。

三.吹打分散細胞：

1. 吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。

 4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四.分裝稀釋細胞：

1. 分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml，最后要做好標記 。

五.繼續培養：

用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。

傳代細胞培養注意事項：

1. 嚴格的無菌操作。
   

2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多  因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。