細胞傳代實驗_消化法

細胞

胰蛋白酶酒精PBS

超凈工作臺酒精燈酒精棉球培養箱顯微鏡吸管離心管離心機

一、傳代前準備

1.  預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2.  用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.  正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.  點燃酒精燈，注意火焰不能太小。

5.  準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。

6.  取出預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

7.  從培養箱內取出細胞，注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

8.  打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

9.  稍微搖搖，然后從對側倒掉培養液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精燈。

二、胰蛋白酶消化

1.  加入消化液：用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。

2.  顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，然后讓其停止消化。

3.  倒掉消化液加入培養液，棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養液。注意要在對測加入培養液。

三、吹打分散細胞

1.  吹打制懸：用吸管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2.  吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10 ml 離心管中。

3.  平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1 000轉/分鐘離心5分鐘。

4.  棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2 ml 培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四、分裝稀釋細胞

1.  分裝：將細胞懸液吸出分裝至2~3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

2.  顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5x10⁵/ml，最后要做好標記。

五、傳代培養

用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO₂培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25%時為一個+，占50%為++，占75%時為+++。

1.  嚴格的無菌操作

2.  適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin）

配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。

步驟：先配100 ml PBS。 稱胰酶0.25 g。加入PBS中，低速攪拌。調pH7.4。過濾，分裝，-20℃保存，4℃短期內用完。

注意：低速很重要，機械攪拌對酶是一種沖擊，如果起沫，酶就變性了。低溫，防止酶失活；對難消化的細胞，在上述配方中，加入0.02 g 的EDTA（0.02%）

根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：懸浮生長細胞傳代、半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）、貼壁生長細胞傳代。

培養細胞傳代根據不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。