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材料
無菌
準備凍存的細胞（如果是貼壁細胞：配制無菌PBSA和0.25%的粗胰蛋白酶）
生長培養基（血清能促進冷凍后細胞的存活；血清濃度可達50%，或用純血清。如血清使用于不需要血清的細胞時，在復蘇后應清洗掉。）
細胞保護劑，無雜志（見前）：二甲基亞砜保存于玻璃瓶中或聚丙烯管中，或新鮮準備的甘油，治愈普通容器中
注射器：1~5ml，用于分裝甘油（有毒）
塑料小管，預先標記上細胞系的名稱以及凍存日期
非滅菌
血細胞計數板或電子細胞計數器
儲存管或支架（支架可能已經在凍存器中了）
凍存用的隔熱容器：聚苯乙烯盒襯以脫脂棉，或泡沫塑料隔熱管（圖20.2； 或使用可控制冷凍速率的冷凍箱，圖20.5）
手套，腈制的
  操作步驟
1. 確保細胞滿足冷凍標準， 肉眼及顯微鏡觀察；
（a） 外觀健康
（b）形態學特征
（c）生長周期（應處于平臺期前的對數生長晚期）
（d）無污染
2. 使細胞生長至對數生長晚期，若為貼壁細胞，用胰酶消化，并進行細胞技術（見方案13.2）。若為懸浮生長細胞，進行細胞計數并離心。
3. 懸浮細胞的濃度為：2x106 個~2x107 個細胞/ml.
4. 將以下任意一種細胞保護劑加入到生長培養基中，配制凍存液：
（a） 加10%~20%的二甲基亞砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。
安全提示
二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜，包括皮膚和橡膠手套[Horita and Weber, 1964] 。因此，任何常用的具有潛在危險的物質（如致癌劑）均可能穿透皮膚，甚至能透過橡膠手套而進入血液循環。存在任何毒性的情況下，均應謹慎處理。
5. 用凍存液將細胞懸液按1：1的比例稀釋至細胞度濃約為1x106 ~1x107 /ml ,此時DMSO的濃度為5%-10%（或甘油濃度為10-15%）。建議勿將凍存管置于冰上，減少細胞退化。使用DMSO時，室溫操作30min是無害的，當使用甘油時，則對細胞是有益的。
6. 將細胞懸液分裝至預先標記好的凍存管中，蓋上蓋子，擰緊，密封，注意不要太緊，避免螺旋扭曲變形。
7. 將凍存管夾在鋁條上，裝入儲存筒中（圖20.2），或將其松散地排列在抽屜儲存器中。
8. 將凍存管通過上述方法之一以1℃/min的速率進行冷凍。使用隔熱保溫的方法，使凍存管達到-70℃，若最初溫度為20℃，則需4~6h，但最好于-70℃過夜。
9.當凍存管溫度達到-70℃或更低時，在將其從-70℃或能控制冷凍速率的冷凍柜中轉移出來之前，檢查冷凍記錄，確定液氮罐中存放凍存管的合適位置。
10.
將凍存管轉移至液氮冷凍罐中，最好不要使其浸沒在液氮中，將放油凍存管的鋁條和紙質管放入預先確定的儲存筒中，或將個別凍存管放入預先確定的抽屜中。該步
驟必須迅速（＜2min），因為凍存管會以越10℃/min的速度升溫，如果溫度上升超過-50℃，細胞會迅速惡化。
安全提示
將凍存管放入液氮時，必須使用保護性手套和面罩。
11.凍存管安全地置于冷凍罐后，必須在冷凍目錄中進行記錄（表20.2和表20.3）
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